臭氧對大鼠角膜堿燒傷后氧化應激損傷的抑制效應＊

夏清平，孫小彤，袁嘉喆，徐 超，鄧 麗

眼角膜堿燒傷是常見的眼外傷之一，在化學燒傷中占比最高，通常是由特殊的職業或行為引起，高致殘率嚴重影響患者的生活質量［1］，早期有效的治療對于恢復視功能和減少并發癥非常重要。目前臨床針對角膜堿燒傷的早期治療主要以清水或生理鹽水沖洗、激素以及各種修復功能的滴眼液為主，效果有一定的局限性，如何進一步提高治療效果是臨床上迫切需要解決的問題［2］。

臭氧是一種超活性氧，由于其強大的氧化性、氧溶解性和殺菌特性，近年來在臨床上備受重視。研究證實［3］，臭氧水溶液對兔眼煙曲霉菌性角膜潰瘍具有很好的抗菌治療效果，與氟康唑滴眼液的比較，療效相似且具有天然不耐藥、成本低等優勢。肖彩雯等［4］通過體外滅菌實驗研究進一步證實了臭氧生理鹽水對真菌性角膜炎的治療效果，并確定了最佳臭氧溶液治療濃度。筆者通過建立大鼠角膜堿燒傷模型，驗證臭氧可以減輕氧化應激反應并觀察有效的治療濃度，為臨床治療角膜堿燒傷提供新的診療思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備 SPF級健康SD雌性大鼠30只（體重250～300 g，由牡丹江醫學院醫藥研究中心動物房提供）隨機分為空白對照組、模型組、低濃度（2 mg/L）臭氧治療組，中濃度（3 mg/L）臭氧治療組，高濃度（4 mg/L）臭氧治療組，每組6只。大鼠堿燒傷模型制備：以4 ml/kg的劑量使用10%水合氯醛溶液腹腔注射大鼠，進行麻醉。剪切直徑為3.0 mm的圓形濾紙，在1 mol/L NaOH溶液中浸泡60 s，并用其他濾紙將多余液體吸干后，迅速將其附著于角膜表面中央45 s，隨后快速使用生理鹽水于結膜囊沖洗70 s。在角膜中央可以看到灰白色的灼燒區域，呈圓形，大小相同表示建模成功。治療方案：堿燒傷模型組滴眼生理鹽水，3滴/次，3次/d，連續7 d。將不同濃度的臭氧溶解到滅菌注射用水中，制備成低濃度組（2 mg/L），中濃度組（3 mg/L），高濃度組（4 mg/L），滴眼3次/d，滴注方式同上。治療第7天后，處死大鼠、取材一部分置于EP管中，并儲存于-80℃冰箱中備用（ELISA法測SOD/MDA）。

1.2 形態學觀察 用裂隙燈顯微鏡（SLM2型，重慶康華）分別在堿燒傷后第1、3、7天對大鼠眼角膜觀察角膜溶解 （使用Pfister評分標準）［5］、角膜混濁（Holland評分標準）程度［6］。計算角膜新生血管長度及面積，公式：S=C/12×3.1416［r2（r-l）2］，C 為角膜血管網所占的圓周數，l為新生血管的生長長度，r為角膜半徑。

1.3 SOD/MDA的檢測方法 使用SOD/MDA ELISA試劑盒（南京建成生物），使用硫代巴比妥法測定樣本中MDA的含量。SOD試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人超氧化物歧化酶（SOD）水平。具體步驟參照試劑說明書。

1.4 統計學處理 用SPSS 11.0統計軟件進行SOD、MDA 數據處理。 計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析的方法，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 臭氧對大鼠眼角膜堿燒傷后的治療作用 臭氧水可以有效降低角膜溶解面積、減輕角膜混濁度、抑制角膜新生血管面積、促進角膜恢復。與模型組相比，臭氧治療組（高、中、低劑量組）術后7 d與術后1 d相比角膜溶解面積、角膜混濁度明顯減少，角膜新生血管面積明顯降低，其中，中濃度組（3 mg/L）效果最為明顯（P＜0.01）。 見表 1。

2.2 臭氧對大鼠眼角膜堿燒傷后氧化應激的抑制作用 角膜堿燒傷后，與對照組相比MDA含量明顯增加，SOD活力明顯降低（P＜0.05）。經過臭氧治療后明顯降低角膜的氧化應激反應。與模型組相比，中劑量治療組明顯降低角膜組織中 MDA的表達（P＜0.05），增加 SOD 含量的表達（P＜0.05）。 見表2。

3 討論

人體除眼角膜外，其他部位的氧供大部分來自于呼吸系統，而眼角膜的氧供80%是通過與外界空氣接觸而獲得，15%來自于角膜緣血管，5%來自房水［7］。空氣和瞼結膜血管提供的氧通過淚液傳遞給角膜。當角膜堿燒傷后，角膜組織恢復過程中對氧的需求增加，但目前臨床上使用的眼部治療用品，多以抗炎、促修復為主，缺少直接釋氧、供氧的治療方法。臭氧（O3）由3個氧原子組成，是氧氣的同素異形體，氧化性更強、水溶性更高，溶解度是普通氧氣的10倍，更易溶于血液和組織液，增加游離氧的含量，提供更充足的氧化作用和氧飽和作用。常溫常壓下，其穩定性較差，半衰期僅為30～60 min，可自行分解為氧氣并同時釋放一些能量，有利于補充細胞的能量供給，提高細胞的代謝能力［8，9］。 臭氧溶于水增加了溶解氧的含量，直接作用于組織表面，有利于受損組織細胞攝取氧、促進組織修復［10］，該實驗通過鏡下觀察角膜組織證實臭氧水可以有效降低角膜溶解面積、減輕角膜混濁度、抑制角膜新生血管面積，促進角膜恢復。通過對不同治療濃度的比對，筆者發現中等劑量（3 mg/L）的臭氧水治療效果最好。

表1 不同濃度的臭氧對大鼠角膜堿燒傷后的治療作用

表2 不同濃度臭氧對堿燒傷眼角膜組織中MDA/SOD含量表達的影響（x±s）

臭氧本身是一種強氧化劑，文獻報道［11］適當的臭氧刺激可以誘導體內抗氧化反應增強，清除過多的氧自由基，降低炎性反應，繼而減輕氧化應激反應。其主要機制［12］是通過增強丙酮酸鹽的氧化羧基化作用，提高細胞內ATP和2，3-DPG水平，激活三羧酸循環，增加多種氧自由基清除酶的生成，例如谷胱甘肽過氧化氫酶 （GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）等。通過測定SOD活性和MDA的含量證實了臭氧可以降低角膜堿燒傷后引發的氧化應激損傷，這可能是臭氧促進角膜恢復的機制的之一。臭氧由于是一種氧化劑，相比傳統的生理鹽水、激素以及各種抗生素藥水而言是一種天然不耐藥的抗生素，具有無依賴性、價格低廉、使用方便等諸多優勢。

由于該實驗的設計初衷是證實臭氧治療降低氧化應激損傷的有效性，因此僅觀察了術后7 d的角膜恢復情況，計劃在以后的實驗中延長觀察時間或增加組織形態學的檢測，以進一步證實結論。