快生長分枝桿菌軟組織感染的鑒定及耐藥性分析

周 佳， 金 博， 肖 楠， 黃 磊， 孫立穎

（1.北京大學第一醫院檢驗科，北京 100034； 2.北京清華長庚醫院檢驗科，北京 102218）

快生長分枝桿菌（rapidly growing Mycobacterium，RGM）可引發軟組織感染和肺部感染等多種疾病[1]。RGM主要分為偶發分枝桿菌復合群、龜-膿腫分枝桿菌復合群和恥垢分枝桿菌復合群，這些亞種復合群的共同點是都具備特征性的長鏈脂肪酸——分枝菌酸，7 d內可在多種固體培養基上快速生長出肉眼可見的菌落，3 d～2周保持芳基硫酸酯酶活性，并且不產生或較慢產生任何色素[2-3]。偶發分枝桿菌復合群包括2個已知種和1個至少包括1個種的不明分類群[4]，鼻疽分枝桿菌、塞內加爾分枝桿菌、偶發分枝桿菌等一系列分枝桿菌都屬于這個復合群[5]。龜-膿腫分枝桿菌復合群[6]還包括2001年被發現的Mycobacterium immunogenum[7]。恥垢分枝桿菌復合群包含Mycobacterium goodii和Mycobacterium wolinskyi[8]。在分子生物學證據出現之前，龜-膿腫分枝桿菌復合群和偶發分枝桿菌復合群中的成員被認為是亞種或只是不同血清型，但16S rDNA測序結果證實這些血清型或亞種其實更有可能是不同的種。本研究選取北京大學第一醫院2010年以來分離到的3株RGM，其中2株是泌尿外科手術切口感染病原菌，另外1株是外傷感染病原菌，分別采用激光解析電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）檢測和16S rDNA、rpoB基因測序進行菌種鑒定，并分析其藥物敏感性，以加強臨床對RGM的認識。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集北京大學第一醫院2010年以來分離自3例患者的3株RGM。（1）患者1。男，22歲。既往體健，否認傳染病和遺傳病史。自訴1年前左足曾被釘子扎傷2個月后局部腫脹化膿，合并左腹股溝淋巴結多發腫大，右側胸腔積液，發熱，經外院診斷為分枝桿菌感染。經清創及抗菌治療后創面愈合。后左足膿腫復發，清創換藥后傷口愈合出院。4個月后再復發，膿液送檢驗科細菌室，檢出RGM。（2）患者2。女，52歲。因“右腎上腺囊腫”，于外院行腔鏡手術，術后低熱，右腰部切口紅腫、破潰、流膿、不愈，清創縫合術后切口再次紅腫破潰，B超提示右腰部瘢痕下積膿，自訴患高血壓、慢性乙型肝炎6年，病情平穩，否認患其他慢性病。傷口膿液送細菌室進行細菌培養，并查抗酸桿菌，結果陰性。手術擴創后取壞死組織再送檢驗科延長培養時間查致病菌，結果回報確認RGM。（3）患者3。男，60歲。否認有慢性病史。4個月前因左腎積水和無功能于外院行左側輸尿管切除術。手術成功，且無術后感染跡象，遂出院。3個月前無誘因發現左腰部原引流口有血性滲出液，未明確診斷病原菌，傷口遷延不愈形成竇道，后經竇道內肉芽組織培養，確診RGM感染。

1.2 儀器與試劑

哥倫比亞血平皿（英國OXOID公司），抗酸染色液[貝索（中國）公司]，質譜儀（德國Bruker公司）。

1.3 方法

1.3.1 細菌培養與鑒定 樣本接種于哥倫比亞血平皿，35℃ 5% CO2條件下培養72 h，形成特征性菌落。采用MALDI-TOF MS進行菌種鑒定，并進行抗酸染色，同時送菌懸液進行16S rRNA和rpoB基因測序，16S rRNA引物為：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'；rpoB引物為：5'-CGACCACTTCGGCAACCG-3'和5'-TCGATCGGGCACATCCGG-3'。

1.3.2 體外藥物敏感性試驗 采用E-test法對3株RGM進行體外藥物敏感性試驗，折點參考美國臨床實驗室標準化協會M24-A2文件[9]。配制0.5麥氏單位濃度的菌懸液，以哥倫比亞血平皿為培養基，72 h后判讀結果；對克拉霉素的藥物敏感性7 d后判讀結果。

2 結果

2.1 RGM感染患者臨床特征總結

3例RGM感染患者中，2例泌尿系手術后傷口形成感染性竇道，1例足部外傷后感染，并累及腘窩淋巴結。3例患者病程均在4個月以上，感染創口和竇道均較深，除抗菌藥物治療外，均需外科切開清創引流，引流液、膿液無臭味，創面可產生肉芽組織，并受累淋巴結炎性反應。抗菌藥物用藥時間均在1個月以上，期間可繼發金黃色葡萄球菌等細菌感染。3例患者均無導致免疫抑制的基礎病。

患者1：手術2個月后左足膿腫未檢出分枝桿菌，結核菌素實驗++，傷口膿液檢出銅綠假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌；術后4個月查體見左足小膿包破潰，左腘窩出現軟質包塊，觸之有輕壓痛，切口按壓可有少量膿液，左腹股溝可及腫大淋巴結。臨床使用左氧氟沙星0.75 g，每日1次；利福平 0.6 g，每日1次；克拉霉素0.5 g，每日2次。1個月后傷口愈合良好，出院。

患者2：查體見手術切口瘢痕長5 cm，紅腫，隆起，3個小傷口，流膿，膿液無臭味。傷口約9 cm深，很窄，僅容12號尿管通過，內可刮出炎性肉芽組織。電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）結果示竇道深，范圍廣，近腰大肌及腎上腺手術區域（圖1）。剪開創面清創引流后，使用左氧氟沙星0.75 g，每日1次；利福平0.6 g，每日1次；克拉霉素0.5 g，每日2次。創口逐漸痊愈，6周后出院。

圖1 患者2 CT竇道造影

患者3：1個月前因左腰部傷口仍有血性滲出液流出，入院后CT結果見圖2。傷口分泌物培養結果為RGM，給予左氧氟沙星等抗感染治療1個月，無明顯改變。查體見左腰部前方一外口約0.5 cm竇道，深度約11 cm，負壓吸引可見棕褐色引流液，左腰部稍后方可見1處外口約1.5 cm潰瘍，深度約4 cm，無滲出，皮膚無紅腫，取引流液進行培養，再次確認生長RGM。給予阿奇霉素0.5 g，每日1次；左氧氟沙星0.75 g，每日1次化療1個月后病情穩定，帶藥出院。

圖2 患者3 CT竇道造影

2.2 細菌鑒定結果

患者1有疑似RGM菌落生長，分純后取48 h生長菌落進行鑒定，質譜鑒定結果為鼻疽分枝桿菌，基因測序結果亦為鼻疽分枝桿菌；患者2有疑似RGM菌落生長，分純后取48 h生長菌落進行鑒定，質譜鑒定結果為分枝桿菌屬，基因測序結果為偶發分枝桿菌，取信測序結果，鑒定為偶發分枝桿菌；患者3有疑似RGM菌落生長，分純后取48 h生長菌落進行鑒定，質譜鑒定結果為膿腫分枝桿菌，基因測序結果亦為膿腫分枝桿菌，鑒定為膿腫分枝桿菌。3株分純后的菌株生長速度均較快，72 h生長菌落形態見圖3。

圖3 鼻疽分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和偶發分枝桿菌培養72 h結果

2.3 體外藥物敏感性試驗結果

對M24-A2文件[9]上有折點的藥物（阿米卡星、亞胺培南、妥布霉素、頭孢西丁、復方磺胺甲噁唑、環丙沙星、利奈唑胺和克拉霉素）進行藥物敏感性試驗，此外還增加了醫院臨床常用的抗菌藥物，包括左氧氟沙星、利福平和阿奇霉素的最小抑菌濃度報告。3株細菌對阿米卡星、妥布霉素、亞胺培南和利奈唑胺均敏感，對復方磺胺甲噁唑均耐藥。見表1。

表1 3株RGM體外藥物敏感性試驗結果

3 討論

本研究選取2010年至今北京大學第一醫院3例軟組織RGM感染病例，1例是外傷后慢性創口和淋巴結感染鼻疽分枝桿菌，2例是泌尿外科術后切口感染偶發分枝桿菌和膿腫分枝桿菌形成深度超過10 cm的竇道。由于某些尚不清楚的原因，RGM感染病例基本都集中在北半球的發達國家，推測可能和診斷治療水平有關[10-11]。美國2007年發布的《診斷治療和預防非結核分枝桿菌指南》[11]可見，美國分離的RGM絕大部分都是肺部感染來源，只有3%的淋巴結感染和3%的軟組織感染來源。亞洲地區的病例情況也類似，肺部感染病例最多[1，10]。歐洲以慢速生長的堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌等為主，亞洲，尤其是東亞，以RGM（偶發分枝桿菌復合群、龜-膿腫分枝桿菌復合群以及恥垢分枝桿菌復合群）感染病例為主[10]。有文獻報道的軟組織感染爆發包括手術后感染、外傷感染和注射后膿腫等[12-14]。污染菌的來源為年久失修的供水管道系統，未消毒徹底的內鏡或氣管鏡等[13]。在我國臺灣省北部一家醫療中心內曾經出現過RGM的爆發[15]。

很多R G M 感染與患者免疫抑制狀態有關[11-12]，但是開放性創傷后RGM感染也可發生于免疫正常者[11-12]。本研究的3個病例都不伴有造成免疫抑制狀態的基礎疾病，外傷或手術破壞了表皮組織的屏障作用是導致感染發生的先決條件。

本研究分離出的1株鼻疽分枝桿菌和1株偶發分枝桿菌都是偶發分枝桿菌復合群的成員，根據相關研究結果[13，15]和診斷治療指南[11]，偶發分枝桿菌和恥垢分枝桿菌對于很多口服抗菌藥物都比較敏感，100%敏感的藥物包括左氧氟沙星、環丙沙星和磺胺類，但是對頭孢西丁和多西環素只有50%的敏感可能性。治療時至少要采用2種藥物聯合。因為治療時間往往長達1年，藥物的選擇和患者的耐受性有關。對于嚴重的皮膚、骨骼、軟組織偶發分枝桿菌感染，最少應采用2種藥物治療4個月，骨骼感染推薦治療6個月。對于較大范圍感染，膿腫形成，或藥物治療存在困難時應采取手術方式。本研究病例普遍采取了切開引流的有創操作，或者去除導管或假體等感染源頭。本研究中第3個病例分離出的是膿腫分枝桿菌。膿腫分枝桿菌天然對標準的抗結核治療藥物耐藥[16]，而且由于膿腫分枝桿菌種群內部藥物敏感性的異質性，分離出的每個菌株都推薦依照體外藥物敏感性試驗結果進行藥物治療。雖然相關指南[11]認為未經治療的膿腫分枝桿菌對克拉霉素100%敏感，但是2002年我國臺灣的研究結果顯示，膿腫分枝桿菌對克拉霉素的敏感率只有50%左右，對頭孢西丁和亞胺培南敏感率也較低[13，15]。對于皮膚軟組織感染，相關指南[1]推薦的治療方法是克拉霉素1 g/d，或阿奇霉素250 mg/d，合并使用胃腸外藥物（阿米卡星或頭孢西丁或亞胺培南）。敏感性最強的胃腸外藥物是阿米卡星，推薦療程和鼻疽分枝桿菌相同，都是最少4個月。必要時輔以外科手術[10]。最近的研究結果顯示，由于很多RGM菌株都含有一種紅霉素核糖體甲基化酶，這種酶可被緩慢誘導產生，因此對于克拉霉素等大環內酯類抗菌藥物的藥物敏感性試驗的報告時間應延長至14 d[17]。本研究7 d之后觀察，2株RGM的克拉霉素藥物敏感性試驗結果都是中介，膿腫分枝桿菌結果是耐藥，提示大環內酯類抗菌藥物應限制用于RGM的治療。

本研究中分鼻疽枝桿菌和偶發分枝桿菌感染病例都經驗采用左氧氟沙星+阿奇霉素+利福平的療法。雖然沒有可以依據的折點，但是通過最小抑菌濃度判斷，這2株RGM均對左氧氟沙星敏感，鼻疽分枝桿菌對阿奇霉素耐藥，偶發分枝對阿奇霉素敏感。本研究中3例患者治療效果均很好，2例患者經手術清創引流，最后都痊愈出院。而從最小抑菌濃度分析，膿腫分枝桿菌對阿奇霉素敏感，左氧氟沙星的最小抑菌濃度較高，最后出院時也未做到完全痊愈。符合膿腫分枝桿菌治療較偶發分枝桿菌復合群困難的特點。

綜上所述，本研究中3株RGM的藥物敏感性試驗結果與文獻[10-11，13-18]基本一致。RGM因較罕見，本研究結果可為臨床進一步認識RGM，并有效治療RGM感染提供幫助。