長鏈非編碼RNA ANRASSF1在胃癌中的表達(dá)及其胃癌預(yù)后相關(guān)因素的分析

張 峰，唐建榮，王振東，邱紅雨

(駐馬店市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，駐馬店 463000)

胃癌(gastric cancer，GC)是常見的消化道惡性腫瘤，位列癌癥相關(guān)死因第三位[1]。近年來，GC的治療手段和診斷技術(shù)不斷進(jìn)步，但GC的發(fā)病率和死亡率仍沒有改善[2]。早期GC患者可通過手術(shù)治愈，但大多數(shù)患者就診時已處于晚期，這是GC患者預(yù)后不良的一個重要原因[3-4]。GC的異質(zhì)性是導(dǎo)致其臨床結(jié)局較差的另一個重要原因[5]。了解胃癌的分子異質(zhì)性，有助于診斷和治療。研究GC背后的分子機(jī)制，有助于找到胃癌新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。lncRNA是非編碼RNA長度超過200 bp的分子，參與基因表達(dá)、調(diào)控和各種細(xì)胞機(jī)制，如細(xì)胞分化、增殖、凋亡和細(xì)胞周期阻滯等[6-7]。ANRASSF1位于3p21.31，是內(nèi)源性非剪接非編碼RNA，通過招募多梳抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)到RASSF1A啟動子上，降低RASSF1A(一種抑癌基因)的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究主要檢測ANRASSF1在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，將ANRASSF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中，檢測其對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，分析ANRASSF1的表達(dá)水平與胃癌患者臨床特征的相關(guān)性及其對患者生存率的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試藥

人胃黏膜細(xì)胞GES-1和人胃癌細(xì)胞MGC-803、SCG-7901、BGC-823均購于中國科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心；MCDB151培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、lopti-MEM培養(yǎng)液、0.25%胰酶-EDTA均購于美國Gibco公司；青鏈霉素雙抗購于碧云天生物技術(shù)有限公司；MTT粉末、結(jié)晶紫粉末和二甲基亞砜購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購于美國Corning公司(型號7030349，小孔為8.0 μm)；Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 胃癌組織收集

收集2010年1月至2013年1月在我院接受胃癌手術(shù)治療的患者組織，其中胃癌組織樣本74例，胃癌旁組織樣本32例。收集的組織樣本先放置液氮中迅速冷凍，然后置于-80℃冰箱中待用。所用組織均由2名病理科醫(yī)生做出診斷。本實驗經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬同意，并簽署知情同意書。

1.3 qRT-PCR分析

按照Trizol試劑說明提取組織和細(xì)胞中的總RNA。ANRASSF1上游引物序列為5′-TTACCTCACACTGCTACG-3′、下游引物序列為5′-CGATAGAGATCCAACTGT-3′；ANRASSF1模擬物上游引物序列為5′-CGTCACCTCTTAGGCTTGGA-3′、下游引物序列為5′-CATTGGTGTCGTTGTGCTCT-3′。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄條件為42 ℃、60 min和72 ℃、10 min。cDNA采用Bio-Rad CFX96系統(tǒng)進(jìn)行實時定量PCR檢測ANRASSF1的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參。每個待測基因設(shè)4個復(fù)孔。數(shù)據(jù)通過Bio-Rad CFX96系統(tǒng)進(jìn)行處理，按照公式RQ=2-ΔΔCT計算各組間的倍數(shù)關(guān)系。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

ANRASSF1質(zhì)粒由廣州市銳博生物科技有限公司構(gòu)建。將ANRASSF1干粉用RNase-free H2O配制成20 μmol/L的儲存液后，分裝、凍存?zhèn)溆谩Ｒ让赶疢GC-803和SGC-7901細(xì)胞，并吹散成為單個懸浮細(xì)胞，離心洗滌后用無血清培養(yǎng)基(serum-free medium，SFM)1640培養(yǎng)基重懸，在每孔含有440 μl SFM培養(yǎng)基的24孔板中接種約2×105個/孔的細(xì)胞；將5 μl濃度為20 μmol/L的ANRASSF1加入到50 μl lopti-MEM中，輕輕混勻，室溫孵育5 min；在上述混合液中加入5 μl轉(zhuǎn)染試劑lipofeetamine 2000，輕輕吹打混勻，室溫孵育15 min；將60 μl轉(zhuǎn)染試劑抑制物混合試劑加入含有細(xì)胞的孔板中，輕輕混勻，ANRASSF1的轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L；將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。ANRASSF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MGC-803和SGC-7901細(xì)胞后定義為ANRASSF1組，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞設(shè)為對照組。

1.5 MTT實驗

采用MTT實驗檢測ANRASSF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MGC-803和SGC-7901細(xì)胞后細(xì)胞的增殖情況。將轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞以每孔2×103的密度接種于96孔板中，分別設(shè)置的培養(yǎng)檢測時間為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，每個檢測時間點設(shè)置6個平行孔，20 μl MTT溶液加入檢測孔中，繼續(xù)孵育4 h。然后去除上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液，振蕩5 min后用酶標(biāo)儀檢測570 nm處的吸光度值(OD)，OD值與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。

1.6 Transwell實驗

ANRASSF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MGC-803和SGC-7901細(xì)胞中，檢測細(xì)胞的侵襲能力。分別以2×104的密度接種于小室里面(含有matrigel，是一種細(xì)胞外基質(zhì))，用100 μl無血清培養(yǎng)基懸浮。在小室下部加入500 μl含有10%血清的培養(yǎng)基，孵育48 h。取出小室放入多聚甲醛中固定10 min，然后置于0.1%結(jié)晶紫中染色30 min。用棉簽輕輕擦去小室上部未發(fā)生侵襲的細(xì)胞，然后置于顯微鏡下拍照，每個孔從上至下選擇5個視野。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ANRASSF1在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中高表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，ANRASSF1在胃癌組織中的表達(dá)水平高于胃癌旁組織(P<0.01)，在胃癌MGC-803、SGC-7901、BGC-823細(xì)胞中的表達(dá)水平均高于永生化胃上皮細(xì)胞GES-1(P<0.001)，見圖1。

2.2 ANRASSF1促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901的增殖

將ANRASSF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MGC-803和SGC-7901細(xì)胞中，ANRASSF1組細(xì)胞中ANRASSF1的表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組(P<0.01)。MTT實驗，細(xì)胞培養(yǎng)72 h時檢測到轉(zhuǎn)染ANRASSF1質(zhì)粒組細(xì)胞數(shù)量明顯高于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組(見圖2)。

2.3 ANRASSF1促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901的侵襲

細(xì)胞侵襲實驗，將轉(zhuǎn)染ANRASSF1質(zhì)粒的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)48 h后檢測到轉(zhuǎn)染ANRASSF1質(zhì)粒組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯多于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組(P<0.01)，見圖3。

注：藍(lán)紫色細(xì)胞為發(fā)生侵襲的細(xì)胞(結(jié)晶紫染色，×200)。A：MGC-803-ANRASSF1組細(xì)胞發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯多于MGC-803組，**PP圖3 ANRASSF1促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901的侵襲

2.4 ANRASSF1與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)因素分析和對生存率的影響

qRT-PCR檢測胃癌組織中ANRASSF1的表達(dá)水平，高于胃癌旁組織平均水平的定義為ANRASSF1高表達(dá)組，低于胃癌旁組織平均水平的定義為ANRASSF1低表達(dá)組，χ2檢驗分析ANRASSF1的表達(dá)與胃癌患者性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，結(jié)果見表1。ANRASSF1高表達(dá)組患者TNM分期較高，2、3級的病理分級人數(shù)較多且易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。ANRASSF1高表達(dá)組患者的生存率明顯低于ANRASSF1低表達(dá)組(見圖4和表1)。

注：ANRASSF1高表達(dá)組患者的存活率顯著低于ANRASSF1低表達(dá)組，P圖4 ANRASSF1高表達(dá)和低表達(dá)患者的生存率分析

臨床特征ANRASSF1高表達(dá)組(例)ANRASSF1低表達(dá)組(例)χ2(P值)性別0.034(0.854) 男2219 女1716年齡0.148(0.701) ≤501515 >502420腫瘤大小(cm)0.690(0.406) ≤32721 >31214TNM分期4.841(0.028) Ⅰ/Ⅱ1825 Ⅲ/Ⅳ2110病理分級12.247(0.002) 1級821 2級2010 3級114淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6.709(0.010) 陰性1524 陽性2411

3 討論

ANRASSF1是一個內(nèi)源性非剪接長鏈非編碼RNA，它是從幾個細(xì)胞系和組織中的RASSF1基因座反鏈轉(zhuǎn)錄而成并結(jié)合至PRC2上。ANRASSF1是通過RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，定位在細(xì)胞核，與其他結(jié)合PRC2的lncRNAs相比，它的半衰期較短[8-9]。ANRASSF1在乳腺腫瘤和前列腺腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)高于非腫瘤細(xì)胞系。ANRASSF1異位過表達(dá)降低RASSF1A豐度，并增強(qiáng)HeLa細(xì)胞增殖，而沉默ANRASSF1后可出現(xiàn)相反的效應(yīng)。ANRASSF1可導(dǎo)致抑癌基因RASSF1A的表達(dá)水平降低，因此腫瘤細(xì)胞更容易增殖[10]。最近的數(shù)據(jù)已經(jīng)提出lncRNA在癌癥相關(guān)的調(diào)控途徑中起關(guān)鍵作用，并涉及多種細(xì)胞機(jī)制[11-12]。lncRNA具有原癌基因的功能，在乳腺癌中它的一些表達(dá)模式與雌激素受體(ER)、腫瘤組織學(xué)分級、患者預(yù)后相關(guān)[13-14]。有研究顯示ANRIL和ANRASSF1在胃癌腫瘤中表達(dá)水平升高，且二者之間的表達(dá)有一定的相關(guān)性，預(yù)示ANRIL和ANRASSF1在胃癌的進(jìn)展中起重要作用[15]。

本研究共收集54例胃癌組織樣本，32例胃癌旁組織樣本，通過qRT-PCR檢測ANRASSF1的表達(dá)，結(jié)果顯示在胃癌組織中ANRASSF1的表達(dá)明顯增加。另外，本研究又選用3種胃癌細(xì)胞系和一種永生化胃上皮細(xì)胞，并檢測細(xì)胞中ANRASSF1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在3種胃癌細(xì)胞中ANRASSF1的表達(dá)也明顯提高。為了進(jìn)一步研究ANRASSF1在胃癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，本研究將ANRASSF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MGC-803細(xì)胞中，使其在MGC-803細(xì)胞中過表達(dá)，通過細(xì)胞增殖實驗檢測到，ANRASSF1可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。另外，在小室中培養(yǎng)48 h后，ANRASSF1過表達(dá)的細(xì)胞的侵襲能力明顯增加，說明ANRASSF1可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。為了進(jìn)一步分析ANRASSF1與胃癌患者的預(yù)后是否具有相關(guān)性，本研究根據(jù)胃癌組織中ANRASSF1的表達(dá)水平，將其分為ANRASSF1高表達(dá)組和低表達(dá)組，并分析與患者的性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性χ2檢驗結(jié)果顯示，ANRASSF1的表達(dá)與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)，與TNM分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。ANRASSF1高表達(dá)組中患者的TNM分期和病理分級較高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者較多，因此說明ANRASSF1可促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。另外，ANRASSF1高表達(dá)組患者的5年生存率明顯低于ANRASSF1低表達(dá)組，可作為胃癌患者預(yù)后不良的一個預(yù)測指標(biāo)。

綜上，ANRASSF1在胃癌中表達(dá)增加，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，在胃癌的發(fā)展過程中起重要作用，有望成為胃癌治療的一個新靶點。