山慈菇提取物對肝癌細(xì)胞Huh7增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

方健，王辰男，孟慶剛

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029

肝癌是臨床常見惡性腫瘤之一，大部分患者確診時已處于中晚期，臨床主要采用放療、化療等方法治療中晚期肝癌患者，但效果不佳、患者預(yù)后較差[1,2]。研究顯示，中醫(yī)藥成分具有抗腫瘤作用[3]。山慈菇屬于蘭科植物的干燥根莖，具有抗腫瘤作用，山慈菇提取物(CAE)可通過調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為而發(fā)揮抗腫瘤作用[4,5]，但CAE對肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響鮮見報道。研究顯示，微小RNA-329(miR-329)在肝癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，并可參與肝癌的發(fā)生及發(fā)展過程，而miR-329-3p是從miR-329前體的3′端臂加工而來[6]。含跨膜Bax抑制劑的母體6(TMBIM6)在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并可能參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程[7]。生物信息學(xué)分析顯示，TMBIM6可能是miR-329-3p的靶基因，但目前關(guān)于miR-329-3p與TMBIM6在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制尚未可知。2017年3月～2018年2月，本研究觀察了CAE對肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并分析其對miR-329-3p/TMBIM6的調(diào)控作用，為揭示CAE的抗腫瘤機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞株Huh7購自美國ATCC公司， 將其置于含有10%胎牛血清與青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM完全培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行傳代培養(yǎng)。主要藥物及試劑：山慈菇購自華寶針?biāo)幱邢薰荆籇MEM培養(yǎng)基、胎牛血清與胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher公司，Lipofectamine 2000、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。甲基噻唑基四唑(MTT)購自北京富龍康泰生物技術(shù)有限公司，膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國Sigma公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。兔抗人TMBIM6抗體購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司，兔抗人細(xì)胞周期蛋白1(Cyclin D1)、p21抗體購自美國CST公司，兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。主要質(zhì)粒：miR-329-3p寡核苷酸模擬物(miR-329-3p mimics)及其陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-329-3p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-329-3p)及其陰性對照(anti-miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 CAE制備 精確稱量50 g山慈菇粉末，依次加入500、400、300 mL去離子水中，加熱、冷卻、過濾；加入95%乙醇洗滌，得到山慈菇干粉6 g，參照相關(guān)文獻(xiàn)配置濃度為10、20、30 mg/mL的CAE[8]。

1.3 CAE對Huh7細(xì)胞增殖、凋亡及miR-329-3p、TMBIM6表達(dá)的影響觀察

1.3.1 細(xì)胞分組與處理 取對數(shù)期Huh7細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104/mL，按照100 μL/孔接種于96孔板。將細(xì)胞分為CAE高、中、低劑量組和對照組，CAE高、中、低劑量組分別加入終濃度為30、20、10 mg/mL的CAE，對照組不予特殊處理，作用24 h。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT法。各組均設(shè)置3個復(fù)孔，向每孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，室溫避光孵育5 min。采用酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm處的光密度(OD)值，計算細(xì)胞存活率。

1.3.3 細(xì)胞凋亡能力觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取各組細(xì)胞，1 000 r/min離心6 min，PBS洗滌。加入結(jié)合緩沖液500 μL，依次加入Annexin V-FITC與PI各5 μL，充分混勻。室溫振蕩搖晃孵育10 min，置于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.4 細(xì)胞miR-329-3p、TMBIM6 mRNA表達(dá)檢測 采用實時熒光定量PCR法。取各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。miR-329-3p上游引物5′-GGGAACACACCTGGTTAAC-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。TMBIM6上游引物5′-CATCAACCCCAGCATCCTTC-3′，下游引物5′-ACCAGCCCCACATACAAGTT-3′;內(nèi)參GAPDH上游引物5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′，下游引物5′-TGAAGGGGTCATTGATGGCA-3′。上述引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。miR-329-3p以U6為內(nèi)參，TMBIM6以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-329-3p、TMBIM6 mRNA相對表達(dá)量。

1.3.5 細(xì)胞TMBIM6、Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上孵育15 min；4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min，吸取上清蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，取40 μg蛋白樣品加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮10 min使蛋白變性。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入TMBIM6、Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax、內(nèi)參GAPDH一抗(稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌，加入二抗(稀釋比例均為1∶2 000)，室溫孵育1 h。TBST洗滌，暗室內(nèi)曝光顯影，Image J軟件分析各條帶灰度值。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.4 miR-329-3p與TMBIM6的相互作用觀察 starBase預(yù)測結(jié)果顯示，TMBIM6的3′UTR中含有與miR-329-3p互補的核苷酸序列，證實miR-329-3p與TMBIM6存在結(jié)合位點，見圖1。①雙熒光素酶報告實驗：將含有結(jié)合位點的序列插入熒光素酶報告基因載體，構(gòu)建野生型報告質(zhì)粒WT-TMBIM6。利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點進(jìn)行突變，將含有突變位點的序列插入熒光素酶報告基因載體，構(gòu)建突變型報告質(zhì)粒MUT-TMBIM6。參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別將WT-TMBIM6、MUT-TMBIM6與miR-NC、miR-329-3p mimics共轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組熒光素酶活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。②Western blotting法：參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別將miR-NC、miR-329-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-329-3p轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞，參照1.3.5，采用Western blotting法檢測TMBIM6蛋白相對表達(dá)量。

圖1 starBase預(yù)測結(jié)果

1.5 miR-329-3p對CAE作用后Huh7細(xì)胞增殖、凋亡的影響觀察

1.5.1 細(xì)胞分組處理 取對數(shù)期Huh7細(xì)胞，以1×104/孔接種于6孔板，待細(xì)胞生長融合度達(dá)70%時，將培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為CAE+anti-miR-NC組、CAE+anti-miR-329-3p組，分別參照Lipofectamine2000說明書將anti-miR-NC、anti-miR-329-3p轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞，并加入終濃度為30 mg/mL的CAE處理24 h。

1.5.2 細(xì)胞增殖能力觀察 參照1.3.2，采用MTT法檢測細(xì)胞存活率。

1.5.3 細(xì)胞凋亡能力觀察 參照1.3.3，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5.4 細(xì)胞miR-329-3p表達(dá)檢測 參照1.3.4，采用實時熒光定量PCR法檢測細(xì)胞miR-329-3p表達(dá)。

1.5.5 細(xì)胞TMBIM6及Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測 參照1.3.5，采用Western blotting法檢測細(xì)胞TMBIM6、Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 CAE高、中、低劑量組和對照組細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率比較 CAE高、中、低劑量組和對照組細(xì)胞存活率依次升高，細(xì)胞凋亡率依次降低，兩組間比較P均<0.05。見表1。

表1 CAE高、中、低劑量組和對照組細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與CAE低劑量組比較，#P<0.05；與CAE中劑量組比較，&P<0.05。

2.2 CAE高、中、低劑量組和對照組細(xì)胞miR-329-3p、TMBIM6表達(dá)比較 CAE高、中、低劑量組和對照組細(xì)胞miR-329-3p表達(dá)依次降低，而TMBIM6 mRNA和蛋白表達(dá)均依次升高，兩組間比較P均<0.05。見表2。

表2 CAE高、中、低劑量組和對照組細(xì)胞miR-329-3p、TMBIM6表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與CAE低劑量組比較，#P<0.05；與CAE中劑量組比較，&P<0.05。

2.3 CAE高、中、低劑量組和對照組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 CAE高、中、低劑量組和對照組細(xì)胞Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)均依次升高，p21、Bax蛋白表達(dá)均依次降低，兩組間比較P均<0.05。見表3。

表3 CAE高、中、低劑量組和對照組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與CAE低劑量組比較，#P<0.05；與CAE中劑量組比較，&P<0.05。

2.4 miR-329-3p與TMBIM6的相互作用 ①雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染MUT-TMBIM6+miR-329-3p的Huh7細(xì)胞熒光素酶活性為1.03±0.13，共轉(zhuǎn)染MUT-TMBIM6+miR-NC的Huh7細(xì)胞為1.02±0.09，二者比較P>0.05；共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-TMBIM6+miR-329-3p的Huh7細(xì)胞熒光素酶活性為0.45±0.10，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-TMBIM6+miR-NC的Huh7細(xì)胞為1.01±0.16，二者比較P<0.05。②Western blotting檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-329-3p mimics的Huh7細(xì)胞TMBIM6蛋白相對表達(dá)量分別為0.86±0.13、0.41±0.08，二者比較P<0.05；轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-329-3p的Huh7細(xì)胞TMBIM6蛋白相對表達(dá)量分別為0.90±0.11、1.05±0.10，二者比較P<0.05。

2.5 CAE+anti-miR-NC組、CAE+anti-miR-329-3p組細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率及miR-329-3p表達(dá)比較 與CAE+anti-miR-NC組比較，CAE+anti-miR-329-3p組細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率、miR-329-3p表達(dá)均降低(P均<0.01)。見表4。

表4 兩組細(xì)胞存活率、凋亡率及miR-329-3p表達(dá)比較

注：與CAE+anti-miR-NC組比較，*P<0.01。

2.6 CAE+anti-miR-NC組、CAE+anti-miR-329-3p組TMBIM6及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與CAE+anti-miR-NC組比較，CAE+anti-miR-329-3p組細(xì)胞TMBIM6、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)均升高，p21、Bax蛋白表達(dá)均降低(P均<0.01)。見表5、圖2。

表5 兩組細(xì)胞TMBIM6及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

注：與CAE+anti-miR-NC組比較，*P<0.01。

圖2 兩組TMBIM6及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)(Western blotting法)

3 討論

研究表明，中藥可通過調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程而發(fā)揮抗肝癌作用[9,10]。但中藥治療過程中涉及多種基因或信號通路，目前關(guān)于中藥提取物治療腫瘤的分子機(jī)制尚未闡明。既往研究顯示，山慈菇對肺癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞的增殖均具有明顯的抑制作用[11,12]，CAE可能通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路激活，而抑制胃癌細(xì)胞增殖[13]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示，隨著加入CAE濃度的升高，肝癌細(xì)胞存活率逐漸降低，細(xì)胞凋亡率逐漸升高；這提示CAE可有效抑制肝癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡。

Cyclin D1可正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。p21可抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，并可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而抑制細(xì)胞增殖[14]。細(xì)胞增殖、凋亡失衡與腫瘤的發(fā)生過程密切相關(guān)，Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白，Bax表達(dá)升高后可通過激活線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，隨著加入CAE濃度的升高，細(xì)胞Cyclin D1及Bcl-2蛋白表達(dá)均逐漸降低，p21及Bax蛋白表達(dá)均逐漸升高；這提示CAE可能通過上調(diào)p21表達(dá)、下調(diào)Cyclin D1表達(dá)而抑制肝癌細(xì)胞增殖，同時可能通過調(diào)控線粒體途徑而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

miR-329-3p在宮頸癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-329-3p表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[16,17]。本研究結(jié)果顯示，隨著加入CAE濃度的升高，肝癌細(xì)胞miR-329-3p表達(dá)逐漸升高，提示CAE可能通過上調(diào)miR-329-3p表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究通過雙熒光素酶報告實驗與Western blotting法證實miR-329-3p能夠靶向結(jié)合TMBIM6，并可負(fù)向調(diào)控TMBIM6的表達(dá)，由此推測miR-329-3p可能通過負(fù)靶向調(diào)控TMBIM6表達(dá)而發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，與CAE+anti-miR-NC組比較，CAE+anti-miR-329-3p組細(xì)胞存活率及TMBIM6、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)均升高，細(xì)胞凋亡率、miR-329-3p表達(dá)及p21、Bax蛋白表達(dá)均降低；提示抑制miR-329-3p表達(dá)可明顯降低CAE對肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并可上調(diào)TMBIM6表達(dá)，說明CAE可能通過上調(diào)miR-329-3p表達(dá)、抑制其靶基因TMBIM6表達(dá)而抑制肝癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述， CAE可抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與激活miR-329-3p表達(dá)并負(fù)向調(diào)控其靶基因TMBIM6有關(guān)。