山藥多糖對大鼠急性心肌梗死后心肌細胞凋亡的抑制作用及其機制

王靜 洪炳哲 張習敬 葛魯敏 任海勤

(1貴州盤江投資控股(集團)有限公司總醫院心內科，貴州 六盤水 553530；2齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院心內科六病區)

急性心肌梗死的主要表現形式為心肌細胞凋亡，研究表明冠狀動脈閉塞后造成局部心肌組織缺血缺氧進而導致心肌細胞凋亡〔1〕。急性心肌梗死可促使心肌細胞因缺血缺氧而發生細胞凋亡，通過抑制心肌細胞凋亡可延緩心室重構并減少心肌梗死面積，既往研究報道指出心肌梗死后引發的心肌細胞凋亡是造成心力衰竭等心血管疾病發生的細胞學基礎〔2,3〕。因而如何減少心肌細胞凋亡成為目前研究的主要方向。山藥多糖(CYPS)是山藥的主要成分且屬于補氣中藥，研究表明CYPS在神經細胞凋亡過程中發揮抗氧化等作用〔4,5〕。但CYPS對急性心肌梗死后心肌細胞凋亡的影響尚未可知。上調成纖維細胞生長因子(FGF)9表達可減少缺氧/復氧(H/R)誘導的心肌細胞凋亡〔6〕。FGF9屬于成纖維生長因子家族成員，其表達異常與多種血管疾病發生及發展過程密切相關〔7〕。但CYPS是否可通過調控FGF9表達進而參與心肌細胞凋亡過程尚未見相關報道。本研究通過觀察CYPS對H/R后心肌細胞存活及凋亡的影響，探討其對FGF9表達的影響及其調控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 心肌細胞H9C2購自上海酶研生物科技有限公司。siRNA轉染試劑購自德國羅氏公司；DMEM培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購自美國Sigma公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物公司；放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、電化學發光(ECL)試劑盒均購自上海碧云天生物工程有限公司；兔抗鼠活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4單克隆抗體購自美國Abcam公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)含量檢測試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2構建H/R模型 DMEM低糖培養基充入無菌氮氣，以1 L/min的流量持續30 min，將原培養基更換為DMEM高糖培養基，放入缺氧裝置內進行缺氧處理4 h，充入氧氣進行復氧處理2 h〔8〕。未進行任何處理的心肌細胞作為空白對照(NC)組，H/R處理的心肌細胞作為H/R組。

1.3藥物處理及實驗分組 收集處于對數生長期心肌細胞，隨機分為3組：H/R+75 mg/L CYPS組(心肌細胞缺氧時加入終濃度為75 mg/L 的CYPS進行H/R處理)、H/R+150 mg/L CYPS組(心肌細胞缺氧時加入終濃度為150 mg/L 的CYPS進行H/R處理)、H/R+300 mg/L CYPS組(心肌細胞缺氧時加入終濃度為300 mg/L 的CYPS后進行H/R處理)〔9〕，放入37℃恒溫培養箱內繼續培養48 h。后續實驗首先觀察過表達FGF9對缺氧處理心肌細胞存活率和細胞凋亡的影響，將心肌細胞隨機分為H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-FGF9組，將心肌細胞隨機分為H/R+CYPS組(心肌細胞缺氧時加入終濃度為300 mg/L 的CYPS進行H/R處理)、H/R+CYPS+si-con組(心肌細胞中轉染FGF9-siRNA的陰性對照，轉染成功后在心肌細胞缺氧時加入終濃度為300 mg/L 的CYPS進行H/R處理)、H/R+CYPS+si-FGF9組(心肌細胞中轉染FGF9-siRNA，轉染成功后在心肌細胞缺氧時加入終濃度為300 mg/L的CYPS進行H/R處理)，繼續培養48 h。

1.4MTT檢測細胞存活率 收集對數生長期心肌細胞，調整細胞濃度(5×104個/ml)，以每孔1 ml接種于96孔板，放入37℃恒溫培養箱繼續培養24 h，按照實驗分組處理后，每孔分別加入10 μl MTT試劑，放入37℃恒溫培養箱繼續培養4 h，分別于作用24 h、48 h、72 h、96 h時棄細胞上清液，每孔分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，放入搖床上低速振蕩10 min，充分反應，應用酶標儀檢測波長為490 nm時各孔吸光度值(OD值)，空白對照組僅添加等量培養液，每組均設置3個復孔，細胞存活率=〔(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(正常對照組OD值-空白對照組OD值)〕×100%。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組心肌細胞，棄上清，用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，0.25%胰蛋白酶消化，低溫條件下，1 500 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)，棄上清，預冷PBS洗滌細胞，加入400 μl結合緩沖液懸浮細胞，調整細胞濃度為1×106個/mL，加入5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)染色液，充分混勻后，室溫避光孵育15 min，加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液，充分混勻，室溫避光孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測細胞中FGF9 mRNA表達水平 采用Trizol法提取心肌細胞總RNA，測定RNA濃度，按照逆轉錄試劑盒將2 μg RNA反轉錄為cDNA，嚴格按照qRT-PCR檢測試劑盒說明書配制反應體系，采用2-ΔΔCt法計算FGF9 mRNA相對表達量。

1.7Western印跡檢測心肌細胞CDK4、Cleaved caspase-3、FGF9蛋白表達 取各組對數生長期心肌細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min后進行離心，離心條件為4℃，12 000 r/min轉速，離心15 min(離心半徑6 cm)，收集上清液即細胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白含量，根據十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒配置分離膠，取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE，電泳反應條件為80 V 30 min，120 V 90 min，120 V、2 000 mA條件下轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫條件下用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗滌3次×10 min，4℃孵育一抗(1∶1 000)過夜，TBST洗滌3次×10 min，室溫孵育二抗(1∶20 000)2 h，Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)洗滌3次×10 min，滴加ECL顯影，放入凝膠成像系統并應用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8檢測GSH-Px、SOD含量 采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活力，采用還原型谷胱甘肽氧化法檢測GSH-Px活力，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.9統計學處理 應用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1CYPS對H/R處理心肌細胞存活率、GSH-Px、SOD含量及CDK4表達的影響 H/R組心肌細胞存活率顯著低于NC組(P<0.05)，不同濃度CYPS干預后心肌細胞存活率顯著高于H/R組(P<0.05)，且隨著CYPS濃度的增加而顯著升高(P<0.05)。與NC組相比，H/R組心肌細胞中CDK4蛋白水平及GSH-Px、SOD含量均顯著降低(P<0.05)；相對于H/R組，H/R+75 mg/L CYPS組、H/R+150 mg/L CYPS組、H/R+300 mg/L CYPS組心肌細胞中CDK4蛋白水平及GSH-Px、SOD含量均顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見表1、圖1。

表1 不同濃度的CYPS對缺氧處理心肌細胞存活率和GSH-Px及SOD含量的影響

1)與NC組比較，2)與H/R組比較，3)與H/R+75 mg/L CYPS組比較，4)與H/R+150 mg/L CYPS組比較：均P<0.05,表2同

1～5：NC組，H/R組，H/R+75 mg/L CYPS組，H/R+150 mg/L CYPS組，H/R+300 mg/L CYPS組；圖2同圖1 不同濃度的CYPS對H/R處理心肌細胞CDK4含量的影響

2.2CYPS對H/R處理心肌細胞凋亡的影響 H/R組心肌細胞凋亡率顯著高于NC組(P<0.05)，不同濃度CYPS干預后心肌細胞凋亡率顯著低于H/R組(P<0.05)，且隨著濃度的增加而顯著降低(P<0.05)。與NC組相比，H/R組心肌細胞中Cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)；相對于H/R組，H/R+75 mg/L CYPS組、H/R+150 mg/L CYPS組、H/R+300 mg/L CYPS組心肌細胞中Cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見表2、圖2。

2.3CYPS對H/R處理心肌細胞FGF9表達的影響 H/R組心肌細胞FGF9 mRNA及蛋白水平顯著低于NC組(P<0.05)，不同濃度CYPS干預后心肌細胞FGF9 mRNA及蛋白水平顯著高于H/R組(P<0.05)，且隨著濃度的增加而顯著升高(P<0.05)，見表2，圖3。

2.4過表達FGF9對H/R處理心肌細胞存活率和細胞凋亡的影響 與H/R+pcDNA組相比，H/R+pcDNA-FGF9組心肌細胞存活率顯著升高(P<0.05)，而細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，GSH-Px、SOD含量及CDK4、FGF9蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，而Cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖3、表3。表明FGF9過表達可明顯促進H/R誘導的心肌細胞增殖而抑制細胞凋亡。

2.5沉默FGF9逆轉CYPS對H/R處理心肌細胞的保護作用 相對于H/R+CYPS+si-con組，H/R+CYPS+si-FGF9組心肌細胞存活率顯著降低(P<0.05)，而細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，GSH-Px、SOD含量及CDK4、FGF9蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，而Cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見表4、圖4。表明CYPS可通過上調FGF9表達而保護心肌細胞。

表2 不同濃度的CYPS對缺氧處理心肌細胞凋亡和Cleaved caspase-3、FGF9蛋白及mRNA表達的影響

圖2 不同濃度的CYPS對缺氧處理心肌細胞Cleaved caspase-3、FGF9蛋白表達的影響

1～4：NC組，H/R組，H/R+pcDNA組，H/R+pcDNA+FGF9組圖3 過表達FGF9對H/R處理心肌細胞CDK4和Cleaved caspase-3表達的影響

表3 過表達FGF9對缺氧處理心肌細胞存活率、細胞凋亡、GSH-Px和SOD含量及CDK4和Cleaved caspase-3表達的影響

與NC組相比較：1)P<0.05；與H/R+pcDNA組相比較：2)P<0.05

表4 CYPS和降低FGF9表達對缺氧處理心肌細胞存活率、細胞凋亡、GSH-Px和SOD含量及CDK4和Cleaved caspase-3表達的影響

與NC組相比較：1)P<0.05；與H/R組相比較：2)P<0.05；與H/R+CYPS+si-con組相比：3)P<0.05

1～5：NC組，H/R組，H/R+CYPS組，H/R+CYPS+si-con組，H/R+CYPS+si-FGF9組圖4 CYPS和沉默FGF9表達對缺氧處理心肌細胞FGF9、CDK4和Cleaved caspase-3蛋白表達的影響

3 討 論

心肌梗死區域心肌細胞凋亡率明顯升高，心肌缺血、缺氧等均可誘導心肌細胞凋亡。研究指出，減少心肌細胞凋亡可減少心肌梗死面積并延緩心室重構〔10〕。因而減少心肌細胞凋亡成為治療心肌梗死的主要途徑。既往研究表明，從植物中提取多糖成分可有效保護心肌梗死后的心肌細胞，并抑制H/R所致的心肌細胞凋亡〔11〕。

CYPS可通過降低糖尿病大鼠體內氧化應激反應有效改善大鼠血糖水平，并可保護胰島及血小板功能〔12〕。CYPS可通過增強腦組織中三磷酸腺苷(ATP)酶活性增強機體清除氧自由基能力進而防止老年性癡呆〔13〕。研究表明，CYPS可增強肝癌細胞對胰島素的敏感性及改善細胞葡萄糖消耗能力〔14〕。本研究結果提示CYPS可通過促進CDK4表達進而促進心肌細胞存活。CDK4是正向調控細胞周期的重要因子之一，CDK激活后可與Cyclin形成復合物進而促進細胞周期由G1期進入S期，促進細胞增殖〔15〕。GSH-Px與SOD可構成機體抗氧化防御系統，其含量升高可增強機體抗氧化能力〔16〕。本研究結果提示CYPS可有效提高H/R損傷心肌細胞自由基清除能力，并有效降低氧化應激損傷。Cleaved caspase-3是線粒體凋亡途徑中執行凋亡的重要因子，其表達水平升高可促進細胞凋亡〔17〕。本研究提示，CYPS可通過降低Cleaved caspase-3表達進而抑制H/R導致的心肌細胞凋亡。

FGF9廣泛存在于哺乳動物中樞神經或外周神經系統中，并可有效促進神經元細胞生長，若神經元受損時可明顯促進神經元再生并有效延緩神經元細胞死亡〔18，19〕。FGF9能夠介導單核細胞向M2分化，賦予心臟保護作用〔20〕。本研究提示，CYPS可通過上調FGF9表達而對H/R損傷心肌細胞發揮保護作用。

綜上，CYPS可有效保護H/R損傷心肌細胞，可能與上調FGF9表達及增強抗氧化能力有關，并可降低心肌細胞凋亡率，為臨床合理用藥提供參考依據。但關于CYPS對H/R損傷心肌細胞保護作用的其他作用機制仍需深入研究。