茯苓四逆湯對老年膿毒癥大鼠心肌損傷的保護作用

王評 彭曉洪 黃永蓮 黃亞秀 李少萍 陳冬杰 胡世平

(深圳市龍崗區中醫院重癥醫學科，廣東 深圳 518172)

膿毒癥是重癥監護病房患者的主要死亡原因〔1〕。受基礎病、免疫力低下等因素影響，老年人較青壯年更易發生膿毒癥，且預后更差〔2〕。膿毒癥易繼發心肌損傷，心肌損傷越重，膿毒癥死亡率越高，兩者呈顯著正相關〔3〕。目前多認為Toll樣受體(TLR)介導的炎癥反應與膿毒癥心肌損傷相關，其下游信號通路中核轉錄因子(NF)-κB、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6等促炎因子在發病過程中起重要作用〔4,5〕。心型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)是新發現的極早期診斷心肌損傷的標志物，具有很高的特異性、敏感性，能獨立預測膿毒癥心肌損傷的預后〔6〕。前期研究發現茯苓四逆湯能減輕慢性心力衰竭患者炎癥反應、改善心功能〔7〕。本研究觀察茯苓四逆湯對老年膿毒癥大鼠血清TNF-α、IL-6濃度及心肌細胞NF-κB、H-FABP蛋白表達的影響，探討茯苓四逆湯對老年膿毒癥大鼠心肌損傷的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1試驗動物 115只20月齡SPF級雄性SD大鼠，體重(350±30)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司〔許可證號：SCXK(滬)2017-0006〕。動物實驗通過醫院倫理審查，所有大鼠實驗前適應性喂養1 w。

1.2主要儀器 Fresco D-37520離心機(賽默飛)；ADVIA240全自動生化分析儀(西門子)；165-8001電泳槽(BIO-RAD)；164-5050電泳儀(BIO-RAD)；170-3930轉印槽(BIO-RAD)；TS-1000水平脫色搖床(海門其林貝爾)；MultiSkan3酶標儀(Thermo)；Pro 200精密組織勻漿器(Pro Scientific)等。

1.3試劑 大鼠TNF-α、IL-6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海美軒生物科技有限公司，貨號分別為MEXN-R0019、MEXN-R0015)；Western印跡試劑:兔抗大鼠NF-κB抗體、兔抗大鼠H-FABP抗體及內參Gapdh單抗(Abcam，英國，貨號分別為AB32536、AB45966、Ab8245)，二抗、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)等。茯苓四逆湯(茯苓30 g、熟附子10 g、人參5 g、干姜8 g、炙甘草10 g)由醫院藥劑科提供(深圳市正皇莊中藥飲片有限公司配送)，濃煎成含原生藥1 g/ml，過濾除菌分裝4℃保存備用。

1.4分組及造模 采用隨機數字表法將大鼠分為6組：正常組15只，假手術組、模型組、茯苓四逆湯低、中、高劑量組各20只。參考文獻〔8〕采用盲腸結扎穿孔術制備膿毒癥模型：術前12 h禁食，自由飲水。腹腔注射0.4 ml/kg 10%水合氯醛麻醉，腹部備皮消毒，全身75%酒精擦拭消毒后放入超凈工作臺并固定于手術臺。沿劍突下約2 cm處沿腹正中線剪開腹壁約1 cm，找出盲腸，用5號線結扎約1/3盲腸，用18G針頭貫通穿刺結扎部位的盲腸2次，輕輕擠壓使少量腸內容物溢出，將處理好的盲腸回納腹腔，縫合腹腔。術畢予頸后皮下注射10 ml生理鹽水液體復蘇，同時將大鼠置于37℃加熱板上等待蘇醒。假手術組開腹，除盲腸結扎及穿刺，余同模型組。正常組不進行麻醉及開腹手術。

1.5給藥方法 大鼠蘇醒后自由飲水正常進食，單獨飼養。茯苓四逆湯灌胃劑量參照血清藥理學等效劑量換算公式進行換算〔9〕，350 g大鼠的等效劑量折算為2.1 g，低、中、高劑量分別為1倍(2.1 g/d)、2倍(4.2 g/d)、3倍(6.3 g/d)，用生理鹽水稀釋至10 ml，造模后6 h開始灌胃，每日劑量分2次給藥，持續3 d，正常組、假手術組及模型組相同時間點給予等量生理鹽水灌胃。

1.6觀察指標 每天觀察大鼠的生存狀態和生存時間、死亡數。各組于造模后24 h、48 h、72 h分別隨機取5只處死收集尾靜脈血，離心分離血清后采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測TNF-α、IL-6含量，操作步驟嚴格按照說明書進行。Western印跡檢測NF-κB、H-FABP蛋白表達：采血后處死取心臟，將心肌組織液氮速凍后切成細小碎片，加入RIPA裂解液，用勻漿機研磨研碎，充分裂解后，12 000 r/min離心5 min，取上清。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。經灌膠、電泳、電轉、封閉后分別與NF-κB、H-FABP及GAPDH的一抗(抗體滴度分別為1∶1 000，1∶5 000)和辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(Jackson 1∶5 000)作用，最后采用化學發光法檢測目的條帶，用凝膠成像儀拍照并測定各顯色條帶的灰度值。

1.7統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行χ2檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1一般情況比較 造模后正常組飲食活動無改變，假手術組術后飲食、活動量下降，后逐漸恢復正常；模型組及中藥各組均出現精神萎靡、進食減少、呼吸增快、被毛蓬松、少動、大便稀溏等癥狀，中藥各組24 h后癥狀逐漸改善，改善程度好于模型組，且隨著中藥劑量增大癥狀改善越明顯；造模后72 h，模型組共死亡5只，死亡率25.0%，中藥各組共死亡3只(其中低劑量組死亡2只，中劑量組死亡1只，高劑量組無死亡)，死亡率5.0%，假手術組、正常組無死亡，中藥各組總死亡率顯著低于模型組(P<0.05)。

2.2血清TNF-α、IL-6比較 正常組、假手術組血清TNF-α、IL-6水平無顯著差異(P>0.05)；模型組血清TNF-α、IL-6水平持續升高，48 h后下降，較正常組同時間點均明顯升高(P<0.01)；中藥各組血清TNF-α、IL-6水平24 h后逐漸下降，較正常組同時間點均明顯升高(P<0.05，P<0.0,1)；中藥各組血清TNF-α、IL-6水平同時間點均顯著低于模型組(P<0.01，P<0.05)，且高劑量組降低更明顯；低、中劑量組血清TNF-α、IL-6水平比較無顯著差異(P>0.05)，高劑量組上述指標同時間點均較低劑量組顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組造模后不同時間點血清TNF-α、IL-6水平比較

與正常組比較:1)P<0.05,2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01；與低劑量組比較:5)P<0.05；與24 h比較：6)P<0.05下表同

2.3各組心肌細胞NF-κB、H-FABP蛋白表達比較 正常組、假手術組心肌NF-κB、H-FABP蛋白表達無顯著差異(P>0.05)；模型組NF-κB、H-FABP蛋白表達隨時間升高，48 h達峰值，較正常組同時間點明顯升高(P<0.01)；中藥各組上述指標24 h后回調，高劑量組24 h、48 h NF-κB、H-FABP蛋白表達顯著高于正常組(P<0.05，P<0.01)，72 h無顯著差異(P>0.05)，低、中劑量組各指標同時間點均顯著高于正常組(P<0.05，P<0.01)；中藥各組NF-κB、H-FABP蛋白表達較模型組同時間點均顯著下降(P<0.01，P<0.05)；低、中劑量組各指標同時間點比較無顯著差異(P>0.05)，高劑量組48 h、72 h NF-κB、H-FABP蛋白表達顯著低于低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組心肌細胞NF-κB、H-FABP變化

3 討 論

研究表明〔10〕，膿毒癥的發病率及死亡率隨著年齡增長而升高，65歲以上人群膿毒癥罹患相對危險度是青壯年的13.1倍，老年膿毒癥患者的住院死亡率及1年累計死亡率均高于非老年患者。心臟是膿毒癥常見受損器官，膿毒癥心肌損傷所致心力衰竭患者的死亡率高達70%〔11〕。肌鈣蛋白(cTn)I是心肌損傷傳統的特異性標志物。膿毒癥心肌損傷4～6 h后cTnI已普遍升高，并發心力衰竭的升高更明顯，其升高程度與死亡率密切相關〔12〕。cTnI不能反映超早期心肌損傷情況。H-FABP是心肌細胞內特有的一種小分子蛋白質，當心肌細胞缺血、缺氧時迅速釋放入血，血清水平在1～3 h升高，4～8 h達峰值，12～24 h恢復正常〔13〕。研究表明〔14〕，膿毒癥患者發病1 h血清H-FABP已明顯升高，與病情程度呈正相關，與心功能、生存率呈顯著負相關。動物實驗證實〔15〕，膿毒癥小鼠血清H-FABP升高明顯早于cTnI出現，升高程度與心肌損傷病理改變一致。本研究提示老年膿毒癥大鼠心肌損傷、心功能障礙持續存在。

膿毒癥心肌損傷發病機制復雜，涉及冠脈微血管血流改變、心肌細胞凋亡、內皮功能障礙、線粒體損傷、細胞因子失衡等〔16〕，其中TLR介導的炎癥反應學說被廣泛認可，其信號通路TLR4/NF-κB/TNF-α、IL-6被認為是膿毒癥心肌損傷的主要發病機制之一〔17〕。腸道是膿毒癥的關鍵啟動器官。膿毒癥時腸黏膜損傷，腸道菌群、內毒素移位入血，形成腸源性內毒性血癥，內毒素與TLR4結合并激活單核細胞，隨后啟動髓樣分化因子(MyD88)依賴性/非依賴性通路反應，兩者通過不同信號通路最終共同激活胞質中的NF-κB，活化的NF-κB誘導TNF-α、IL-6基因轉錄，進而合成釋放大量炎癥因子，最終形成全身炎癥反應綜合征，導致包括心肌損傷在內的多臟器損傷〔18〕。研究表明〔19〕，炎癥反應貫穿于膿毒癥心肌損傷疾病始終，炎癥反應程度與預后密切相關，抑制炎癥是心肌損傷治療的重要措施。本研究提示膿毒癥大鼠炎癥反應持續存在，且隨著病情進展而加重，這與心肌細胞H-FABP蛋白表達變化趨勢一致。可見，炎癥反應是心肌損傷的一個重要因素。

膿毒癥屬于中醫學“熱病”“溫病”等范疇。傳統認為正虛毒損，臟腑氣機失調是其基本病機，基本治則為清熱解毒，兼活血、降濁、通腑等法，延至后期，方予回陽救逆之品。事實是，膿毒癥患者多死于休克、心力衰竭等陽氣衰微時。《素問·生氣通天論》云:“陽氣者，若天與日，失其所，則折壽而不彰”。清·鄭欽安《醫理真傳》云:“人之所以立命者，在活一口氣乎。氣者陽也”。可見陽氣乃人體安身立命之根本，只可溫養，不可妄加戳戮。《素問·陰陽應象大論》云：“壯火食氣……少火生氣。”膿毒癥常伴高熱，必然戳戮陽氣，“壯火食氣”，若妄投大劑苦寒之品，易致陽氣耗散乃至厥脫，終成不治之癥。有學者認為膿毒癥發病在于正虛，陽氣衰微是膿毒癥心肌損傷的重要病機，予溫陽益氣活血類中藥取得較好療效〔20〕。筆者認為，膿毒癥心肌損傷為正虛邪實，毒熱傷正，心陽耗竭，陽不化氣，陰血不生，水濕痰濁瘀血等病理產物叢生，壅滯經絡，變證迭起。治以溫陽育陰利水為法，方選茯苓四逆湯。茯苓四逆湯出自《傷寒論》，由茯苓、附子、干姜、人參、炙甘草組成。方中重用茯苓健脾利水，人參滋陰益氣，附子、炙甘草、干姜合為四逆湯溫陽益氣，取“少火生氣”之意。全方藥少量重，直切病機，乃溫陽育陰利水代表方。既往發現〔7，21〕，茯苓四逆湯能降低慢性心力衰竭患者血清TNF-α、晚期糖基化終產物濃度，進而改善心功能、提高患者生活質量。本研究提示茯苓四逆湯能明顯抑制膿毒癥大鼠炎癥反應，減少炎癥因子表達，隨著炎癥反應減輕，中藥各組心肌細胞H-FABP蛋白表達逐漸降低，表明茯苓四逆湯通過抑制膿毒癥大鼠炎癥反應進而減輕心肌損傷、改善心功能，上述治療作用與茯苓四逆湯劑量高低密切相關。