非小細(xì)胞肺癌晚期患者常見中醫(yī)證型淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的差異

吳姍姍 王柏山 張寧 張程 張藝凡 嚴(yán)峰 李志靜

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,遼寧 沈陽 110032)

在過去的10年全國范圍內(nèi)肺癌的發(fā)病率和死亡率都位居腫瘤疾病的榜首。肺癌早期階段無顯著的臨床特點(diǎn)，而且沒有特異性較強(qiáng)的檢查手段〔1〕。大多數(shù)肺癌患者在確診時已處于晚期，嚴(yán)重影響患者的療效和預(yù)后。肺癌病理分型可分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，SCLC通常被認(rèn)為是神經(jīng)內(nèi)分泌來源，占肺癌發(fā)病率的15%左右〔2〕，NSCLC包括鱗癌、腺癌和大細(xì)胞肺癌等,占肺癌發(fā)病的絕大多數(shù)。中醫(yī)并無“肺癌”專病,但咳嗽、咯血、胸痛及肺積等多屬于肺癌范疇。《醫(yī)宗必讀》記載“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”。《素問·評熱病論》記載“邪之所湊，其氣必虛。”中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺癌是由于機(jī)體正氣虛損，陰陽失衡，邪毒乘虛襲肺，邪滯胸中，宣降失司，氣機(jī)不暢，氣血瘀滯，津液輸布不利，津聚為痰，痰瘀膠結(jié)日久所致。肺癌是因虛而得病，因虛而致實(shí)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素、多階段共同參與的復(fù)雜過程，目前T細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞是公認(rèn)的能夠有效監(jiān)督和清除腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。但是越來越多的證據(jù)表明B細(xì)胞在調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答對抗腫瘤方面也發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用〔3〕。因此肺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與機(jī)體的免疫功能有著密不可分的關(guān)聯(lián)。本研究探討NSCLC晚期患者常見中醫(yī)證型的T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及B細(xì)胞的差異。

1 材料與方法

1.1研究對象 本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批及患者的知情同意。選擇遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2017年1～5月期間收治的有病理學(xué)明確診斷的NSCLC晚期患者101例，其中男48例，女53例；年齡42～80歲，平均(53.5±3.7)歲，其中病理學(xué)診斷NSCLC 101例(鱗癌45例，腺癌56例)；TNM分期Ⅲb期71例，Ⅳ期30例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合原發(fā)性NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)〔4〕且無其他腫瘤史；②患者不伴發(fā)自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性骨關(guān)節(jié)病等；③患者未服用激素類藥物或接受免疫抑制劑的治療；④除外活動性(病毒)感染〔5〕。選擇與患者性別年齡相匹配的健康人23例即健康對照(NC)組，其中男12例，女11例；年齡40～77歲，平均(52.3±2.8)歲。中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)參考“十一·五”國家級規(guī)劃教材《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》〔6〕，將肺癌分為4個臨床證型即氣陰兩虛、陰虛痰熱、痰濕蘊(yùn)肺和氣血瘀滯。其中氣陰兩虛36例、陰虛痰熱19例、痰濕蘊(yùn)肺21例和氣血瘀滯25例。主要癥候：①氣血瘀滯型。咳嗽不暢、胸痛如錐刺，痛有定處，或胸悶氣急，或痰血暗紅，便秘口干，口唇紫暗。舌暗紅或紫暗，有淤斑、瘀點(diǎn)，苔薄，脈細(xì)澀或弦細(xì)等；②痰濕蘊(yùn)肺型。咳嗽，咯痰，氣憋，痰質(zhì)稠黏，痰白或黃白相兼，胸悶胸痛，納呆便溏，神疲乏力，舌質(zhì)淡，苔白膩，脈滑；③陰虛痰熱 咳嗽無痰或少痰，或痰中帶血，甚則咯血不止，胸痛，心煩寐差，低熱盜汗，或熱勢壯盛，久稽不退，口渴，大便干結(jié)，舌質(zhì)紅，舌苔黃，脈細(xì)數(shù)或數(shù)大；④氣陰兩虛。咳嗽少痰，或痰中帶血，咳聲低怯，氣短，自汗或盜汗，惡風(fēng)，口干不欲多飲，舌質(zhì)淡紅，或舌質(zhì)紅有齒印，苔薄白，脈細(xì)弱。

1.2主要試劑和儀器 BD公司的FACS Calibur流式細(xì)胞儀、Tritest CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP 試劑、Tritest CD16CD56 PE/CD3 FITC/CD19 APC試劑、10×免洗溶血素。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞和B細(xì)胞的檢測 具體步驟如下:患者清晨空腹采集2 ml外周靜脈全血選擇乙二胺四乙酸二鉀(EDTA)抗凝，將20 μl的CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP試劑和CD16CD56 PE/CD3 FITC/CD19 APC試劑分別加入不同的流式管中，再加入25 μl EDTA 抗凝血，渦旋振蕩混合均勻，室溫避光15 min后，加入經(jīng)10倍稀釋的免洗溶血素(BD公司)450 μl，繼續(xù)室溫避光15 min，樣本溶血充分后流式細(xì)胞FACSCalibur(BD公司)檢測，MULTISET軟件進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)、Spearman 秩相關(guān)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC晚期患者常見中醫(yī)證型T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及B細(xì)胞的表達(dá) CD3+T細(xì)胞表達(dá)水平：氣陰兩虛<陰虛痰熱<痰濕蘊(yùn)肺<氣血瘀滯0.05)；NK細(xì)胞(CD16+CD56+)表達(dá)：NC=氣血瘀滯<陰虛痰熱<痰濕蘊(yùn)肺<氣陰兩虛，其中NC組、氣血瘀滯組顯著低于氣陰兩虛組、痰濕蘊(yùn)肺組(P<0.05)。CD19+B細(xì)胞亞群表達(dá)：痰濕蘊(yùn)肺

表1 各中醫(yī)證型不同淋巴細(xì)胞亞群的比較〔%，M(Q25，Q75)〕

與NC組比較：1)P<0.05，與氣血瘀滯組比較：2)P<0.05，與痰濕蘊(yùn)肺組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

2.2NSCLC晚期患者中醫(yī)辨證分為虛證組(氣陰兩虛和陰虛痰熱組)和實(shí)證組(痰濕蘊(yùn)肺和氣血瘀滯組)，T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及CD3-CD19+B細(xì)胞的表達(dá) T細(xì)胞表達(dá)：虛證組CD3+T細(xì)胞表達(dá)顯著低于實(shí)證組、NC組(均P<0.05)。虛證<實(shí)證0.05)。NK細(xì)胞(CD16+CD56+)表達(dá)：NC<實(shí)證<虛證，其中虛證組和實(shí)證組NK細(xì)胞表達(dá)無顯著差異，但是虛證組顯著高于NC組(P<0.05)。虛證組、實(shí)證組和NC組的CD19+B細(xì)胞表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 虛證組和實(shí)證組不同淋巴細(xì)胞亞群的比較〔%，M(Q25，Q75)〕

與虛證組比較：1)P<0.05

2.3NSCLC晚期患者的相關(guān)性分析 CD3+T細(xì)胞表達(dá)百分比與CD8+T細(xì)胞表達(dá)百分比呈正相關(guān)(r=0.37，P<0.01)；CD3+T細(xì)胞表達(dá)百分比與NK細(xì)胞表達(dá)百分比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.80，P<0.01)，；NK細(xì)胞表達(dá)百分比與CD4+T細(xì)胞表達(dá)百分比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.45，P<0.01)，見圖1。

3 討 論

中醫(yī)定義肺癌是一種全身屬虛，局部屬實(shí)，本虛標(biāo)實(shí)之病證，邪毒聚結(jié)，最易耗傷人體正氣，隨著邪長正消，正氣受戕益甚。可見正虛是肺癌的內(nèi)因,也是推動肺癌發(fā)展的關(guān)鍵,扶正培本及時時顧護(hù)正氣是中醫(yī)對肺癌進(jìn)行辨證施治的核心。中醫(yī)的正氣主要由先天的元?dú)夂秃筇斓闹袣鈽?gòu)成。有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣之法主要改善非特異性免疫，也能在一定程度上改善特異性免疫〔7〕。中醫(yī)學(xué)的正氣理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫理論有相通之處但是不能等同，二者的關(guān)聯(lián)有待深入研究。

免疫系統(tǒng)對于腫瘤細(xì)胞的識別和清除可發(fā)揮免疫監(jiān)督作用，機(jī)體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性〔8〕。依據(jù)表型和功能不同將淋巴細(xì)胞分為不同的淋巴細(xì)胞亞群，其中T細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞〔9〕。目前T細(xì)胞亞群用于監(jiān)測腫瘤的發(fā)展、判斷療效及預(yù)后被普遍認(rèn)可〔10〕。

李際強(qiáng)等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)虛證患者的CD3+T細(xì)胞顯著低于實(shí)證組，本研究結(jié)果與其一致。CD3+T細(xì)胞主要由CD4+和CD8+T細(xì)胞構(gòu)成；CD4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以活化單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，并誘導(dǎo)上述細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答吞噬腫瘤細(xì)胞〔5〕。我們就此推測氣血瘀滯組CD4+T細(xì)胞能夠更好地刺激單核、巨噬和NK細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞，更好地發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視作用，虛證組的細(xì)胞免疫水平顯著低于實(shí)證組。CD8+T細(xì)胞在不同證型均有下降，但是各組間并無顯著性差異，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞特異性識別MHC-Ⅰ類分子結(jié)合的抗原肽復(fù)合物傳導(dǎo)活化信號，通過釋放顆粒酶和穿孔素裂解靶細(xì)胞。Liu等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，作為重要的抗擊腫瘤的免疫細(xì)胞，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞在NSCLC患者的表達(dá)較健康人減少但無統(tǒng)計學(xué)差異，本研究的結(jié)果與之一致。

NK細(xì)胞謂之自然殺傷細(xì)胞，可以非特異性的殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮天然性免疫應(yīng)答的功能〔13〕。之前的研究發(fā)現(xiàn)NSCLC晚期患者NK細(xì)胞的表達(dá)較NC組升高但并無統(tǒng)計學(xué)意義〔14〕，本研究結(jié)果推測氣陰兩虛組、痰濕蘊(yùn)肺組NK 細(xì)胞水平升高可能會使患者天然免疫功能增強(qiáng)，但有待于進(jìn)一步驗(yàn)證NK細(xì)胞的功能。本研究結(jié)果說明NK細(xì)胞表達(dá)與CD3+和CD4+T細(xì)胞表達(dá)是互為消長。當(dāng)CD4+T細(xì)胞發(fā)揮的細(xì)胞免疫功能受損時NK細(xì)胞發(fā)揮的天然免疫功能會增強(qiáng)作為補(bǔ)充。

B細(xì)胞受抗原刺激后，分化增殖為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞可以產(chǎn)生抗體，進(jìn)而對免疫穩(wěn)態(tài)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。B細(xì)胞還能通過分泌細(xì)胞因子和表面特異性的受體來調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞，例如對T細(xì)胞的免疫應(yīng)答發(fā)揮抗原提呈作用。當(dāng)黑色素瘤或其他實(shí)體腫瘤的患者體內(nèi)CD27+和CD19+B細(xì)胞匱乏時，會加速其腫瘤的生長，但是這種現(xiàn)象的機(jī)制尚不清楚〔15,16〕。

綜上，氣血瘀滯組機(jī)體的免疫功能優(yōu)于其他證型。陳永等〔17〕綜合國內(nèi)眾多肺癌中醫(yī)證型的研究分析得出結(jié)論，氣血瘀滯型常見于Ⅰ期、Ⅱ期肺癌患者。中醫(yī)理論認(rèn)為“肺癌一般初起多為邪毒痰瘀壅滯于肺，側(cè)重實(shí)證，虛損不明顯，機(jī)體正氣尚強(qiáng)，若失治，邪毒傷正，肺脾氣虛，遏邪乏權(quán)，則邪毒可乘虛流竄并駐留于臟腑等處，虛損加重，耗氣傷血，傷陰損陽，而導(dǎo)致“氣陰兩虛”的難治境地”。說明氣血瘀滯型的免疫功能尚未發(fā)展到受到重創(chuàng)而失去對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮監(jiān)督作用的程度，所以氣血瘀滯型的預(yù)后較其他證型更好，本研究結(jié)果也印證了這一點(diǎn)，再一次表明傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)是有共識的。中醫(yī)學(xué)的正氣理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫理論的關(guān)聯(lián)有待深入研究。