UPLC 法測定生、制白術配伍枳術丸中10 種成分

臧彬如單國順賈天柱張詩雯周改蓮

（1.廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530001；2.遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600）

枳術丸是僅由白術、枳實2 味中藥組成的治療脾胃內傷的經典方劑［1］，始見于李東垣的《內外傷辨惑論》［2］，后被2015 年版《中國藥典》 一部所收載［3］。方中白術量重于枳實1 倍，乃補重于消，寓消于補［4］；枳實藥性峻烈，需以麩炒緩和其破氣之力［5］，用于脾胃虛弱、食少不化、脘腹痞滿等癥［6］。白術為君藥，其味苦、性溫，可健脾益氣、燥濕利水［7-9］；枳實為臣藥，其味苦、性寒，可下氣化滯、消痞除滿［10］。現代藥理研究表明，枳術丸還能治療小兒厭食、功能性消化不良等癥狀［11］。

近年來，有學者發現麩炒可以促進白術中蒼術酮氧化為白術內酯，但與枳實配伍后卻可使白術內酯還原為蒼術酮［12-13］，這也證明單味藥的炮制機理并不等同于復方中該藥炮制前后的組方和配伍機制。此外，《內外傷辨惑論》 中枳術丸由麩炒枳實、白術組成，而被《中國藥典》 所收載的由麩炒白術、枳實組成，且臨床上麩炒白術以健脾消食、和胃作用為主，這又恰與枳術丸治痞、消食、強胃的功效相應。本實驗采用UPLC 法測定生白術、制枳術丸中10 種成分的含有量，以期證實組方中白術與麩炒枳實配伍的合理性。

1 材料

1.1 儀器 Waters Acquity UPLC H-Class 色譜儀（沃特世科技上海有限公司）；KQ-250DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA1004B電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；AE240型電子分析天平（十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司）；WGL-125B 型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；RO-2640P 型超純水器（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 白術內酯Ⅰ（批號111127）、白術內酯Ⅱ（批號150917）、白術內酯Ⅲ（批號151107）對照品（四川省維克奇生物科技有限公司）；橙皮苷（批號YJ-160226）、柚皮苷（批號100002）、蕓香柚皮苷（批號101222）、柚皮素（批號100368）、橙皮素（批號100456）、辛弗林（批號YJ-151012）對照品（江蘇永健醫藥科技有限公司）；荷葉堿（批號DST180209-051）對照品（成都德思特生物技術有限公司），純度均大于98%。

白術購于安徽亳州、浙江麗水、湖北恩施，枳實購于江西省，荷葉（批號170701）購于安徽致良中藥飲片有限公司，均經遼寧中醫藥大學李峰教授鑒定為正品。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純（德國Merck 公司）；水為超純水，由RO-2640P 超純水器制備。

2 方法與結果

2.1 枳術丸制備 按處方比例稱取白術生品、炮制品各500 g，麩炒枳實250 g，粉碎，過3 號篩，混勻。另取荷葉75 g，加40 倍量水（沒過荷葉表面）煎煮1 h，放涼過濾，殘渣加10 倍量水煎煮1 h，放涼過濾，合并2 次濾液濃縮，濃縮液9 500 r／min離心10 min 后取上清液，用煎液泛丸，干燥，即得。

2.2 色譜條件 ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相0.1% 甲酸（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.4 mL／min；柱溫30 ℃；橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、柚皮素、橙皮素、辛弗林、荷葉堿、白術內酯Ⅱ檢測波長為283 nm，白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅲ為220 nm；進樣量2 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.3 對照品溶液制備 精密量取對照品溶液適量，甲醇溶解并定容于10 mL 量瓶中，搖勻，制成含白術內酯Ⅰ1.123 mg／mL、白術內酯Ⅱ0.115 mg／mL、白術內酯Ⅲ1.061 mg／mL、荷葉堿0.144 mg／mL、橙皮苷0.130 mg／mL、橙皮素0.125 mg／mL、柚皮苷0.134 mg／mL、柚皮素0.130 mg／mL、辛弗林0.162 mg／mL、蕓香柚皮苷0.144 mg／mL 的溶液，即得，密封避光保存。

2.4 供試品溶液制備 取枳術丸適量，研細，取約2.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL 浸泡30 min，稱定質量，超聲處理（700 W、50 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，甲醇定容于25 mL量瓶中，混勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.5 系統適用性試驗 精密吸取供試品、對照品溶液各2 μL，在“2.2”項色譜條件下進樣，測得辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷葉堿、柚皮素、橙皮素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ保留時間分別為1.219、10.707、11.369、11.851、13.423、15.757、16.513、21.233、23.215、24.910 min，且分離度良好，理論塔板數均不低于15 000。見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關系考察 精密吸取“2.3”項下各對照品溶液，甲醇稀釋成6 個質量濃度，在“2.2”項色譜條件下進樣。以峰面積為縱坐標（Y），溶液質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.6.2 精密度試驗 稱取“2.1”項下樣品（浙江麗水）約2.0 g，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下連續進樣6 次，測得辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷葉堿、柚皮素、橙皮素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ峰面積RSD 分別為2.53%、0.5%、1.45%、2.24%、2.81%、3.02%、0.46%、2.04%、1.45%、1.63%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩定性試驗 稱取“2.1”項下樣品（浙江麗水）約2.0 g，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項下色譜條件下于制備后0、2、4、8、12、24 h 進樣，測得辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷葉堿、柚皮素、橙皮素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ峰面積RSD 分別為 2.85%、2.51%、1.96%、0.47%、3.58%、2.72%、2.44%、2.78%、2.96%、3.1%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6.4 重復性試驗 稱取同一樣品6 份（浙江麗水），每份約2.0 g，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣，測得辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷葉堿、柚皮素、橙皮素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ峰面積 RSD 分別為 2.93%、2.48%、2.25%、2.55%、2.43%、2.53%、2.75%、1.75%、1.83%、1.28%，表明該方法重復性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗 稱取同一樣品約1.0 g，共6 份，加入辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷葉堿、柚皮素、橙皮素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ對照品適量，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣，計算回收率。結果，辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷葉堿、柚皮素、橙皮素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ平均加樣回收率分別為100.6%、98.3%、98.9%、99.0%、97.5%、97.7%、98.2%、98.2%、98.7%、100.0%，RSD分別為2.96%、1.89%、2.33%、2.50%、2.22%、2.70%、2.02%、2.17%、2.50%、3.16%。

2.7 樣品含有量測定 稱取3 個產地白術鮮品和1 個產地枳實鮮品適量，按“2.1”“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣，計算含有量。結果見表3。

表3 各成分含有量測定結果（mg／g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論與結論

3.1 指標性成分選擇 白術中內酯類成分具有促進胃腸運動和營養成分吸收的作用，是其主要活性物質［14-15］，因此，本研究選取白術內酯Ⅰ～Ⅲ作為指標。枳實中主要活性物質為生物堿及黃酮兩大類，其中以橙皮苷、柚皮苷及蕓香柚皮苷為代表的黃酮類成分具有抑制平滑肌收縮、改善功能性消化不良大鼠的胃排空和抗氧化抗炎等作用，是枳實中消食的主要活性物質［16-18］。由于枳術丸中使用的是麩炒枳實，炮制的過程可導致黃酮苷類成分的苷鍵發生斷裂，得到其苷元類物質，因此，本研究選取了黃酮苷類物質橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷及其苷元橙皮素、柚皮素作為指標性。此外，生物堿類成分以辛弗林為代表，被《中國藥典》 收載，本研究也以其為檢測指標之一；荷葉汁雖然只作為白術和枳實的粘合劑，但它含有大量生物堿，具有降脂、抑菌等作用［19］，故按照《中國藥典》 規定也選擇其所含荷葉堿作為指標。

3.2 流動相選擇 本研究比較了甲醇-水、乙腈-水、0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈，發現甲醇-水溶液分離效率較低，在220 nm 波長下的末端吸收情況較為嚴重，而乙腈-水系統則具有相對好的色譜分離效果。為了有效改善部分色譜峰的拖尾現象，本研究還加入甲酸以提高分離度。最終，確定流動相為0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸。

3.3 色譜柱選擇 本實驗考察了ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）2 種色譜柱，發現BEH C18色譜柱出峰少，色譜峰的保留時間延長，而HSS T3色譜柱顯著提高了峰容量及對色譜峰的分離效果，這可能與部分成分具有強極性有關，而該柱子對其具有更好的保留效果。因此，本實驗選擇HSS T3色譜柱。

3.4 提取方式選擇 本實驗考察了25%、50%、75%、100%甲醇在超聲法和回流法下的提取效率，發現100%甲醇最高，而2 種提取方法之間沒有顯著性差異，但回流法所用時間較長，重復性較差。因此，本實驗選擇100%甲醇超聲提取。

3.5 白術內酯類成分比較 本實驗發現，不同產地生白術中內酯類成分差異較大，這可能與生長環境及采收、加工方式有關。比較生制品白術與麩炒枳實配伍后白術內酯類成分的變化趨勢顯示，在不同產地白術中含有量均較高的白術內酯Ⅲ在白術麩炒的過程中，僅有部分降低，而經配伍后明顯下降，同時白術內酯Ⅰ含有量明顯升高，這可能是由于白術在炮制的過程中促進了白術內酯Ⅲ向白術內酯Ⅰ的轉化，有利于增強麩炒白術的補益作用［14-15］，而配伍后促進白術中有效成分的溶出（轉化）也表明麩炒枳實與麩炒白術配伍的必要性和合理性。

3.6 黃酮類成分比較 通過對比枳實炮制前后及配伍生制白術后黃酮類成分的含有量發現，枳實生制品中橙皮苷最高，麩炒后枳實中黃酮苷類成分明顯降低，而在與白術進行配伍之后反而升高，表明與白術配伍時對黃酮苷類成分可起到保護作用。同時，麩炒后枳實中黃酮苷元類成分含有量明顯升高，而與白術配伍后降低，進一步表明白術具有增加黃酮苷類成分、降低黃酮苷元類成分的作用。枳實中黃酮苷類成分為其增強胃腸功能的主要活性物質，而麩炒在降低了燥性揮發油類成分含有量的同時，也促進了苷鍵的斷裂，使其改善脾虛患者胃腸功能的作用降低；與白術配伍后可促進具有增強胃腸蠕動作用的苷類成分含有量增加，以保證其健脾消積的作用。枳實中主要活性物質辛弗林經麩炒后由于溫度的影響，其結構遭到破壞，含有量降低，而與白術配伍后增加，同樣體現出配伍的意義［20-21］。另外，荷葉堿含有量在麩炒白術制枳實中更高，也可證實枳術丸以麩炒白術入方的合理性。

本研究從復方配伍與炮制的角度，證明了枳術丸中選用麩炒白術與麩炒枳實配伍的合理性。今后，將繼續從入血成分種類及代謝情況入手，比較生、制白術配伍枳術丸的差異，以期從體內實驗探討組方規律及其合理性。