CLIA值對應RPR滴度的ROC曲線分析及曲線擬合

滕 穎

天津市第二人民醫院檢驗科 300192

梅毒是由蒼白密螺旋體(Treponema pallidum，TP)蒼白亞種引起的一種慢性系統性性傳播疾病，可引起人體多系統多器官的損害，產生多種臨床表現，導致組織破環，功能失常，甚至危及生命[1]。該疾病兼具有個人衛生和公共衛生的重要性，除了直接發病外，還會增加感染艾滋病毒的風險，并可能導致感染母親所生的兒童終身發病。如果不進行治療，疾病可以經過一系列臨床階段后最終導致不可逆的神經或心血管并發癥[2]。WHO曾估計全球梅毒患病人數達到3 640萬，其中發病的人數達到1 060萬。

RPR技術現廣泛用于梅毒診斷和療效隨訪，其優點是價格低廉、操作簡便，但RPR方法同時也存在一些缺點，如可由交叉反應導致假陽性，在早期或一期梅毒中可由于前帶效應出現假陰性。最重要的是人為主觀判定結果，操作者不同可引起結果判讀的差異。尤其在患者的長期治療過程中，極易由于操作人員前后不同導致結果判讀標準不盡相同進而影響對療效的判斷。梅毒螺旋體化學發光免疫試驗 (Chemiluminescence immunoassay，CLIA)客觀性強且量化清晰，更適用于對梅毒的療效觀察。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年4月—2019年4月于本院就診的梅毒患者375例，所有納入者既往均經RPR、CLIA、ELISA及TPPA等檢測確認為梅毒感染，收集這些患者的RPR結果和CLIA結果進行分析。

1.2 儀器與試劑 化學發光法采用美國雅培公司的ARCHITECT i2000SR全自動化學發光微粒子免疫分析儀，試劑為其配套Syphilis TP及相關校準品、質控品，快速血漿反應素環狀卡片試驗(RPR)試劑盒為上海實業科華生物技術有限公司生產。

1.3 統計學方法 將RPR結果和CLIA結果進行spearman相關性分析以確定RPR與CLIA是否有相同的變化趨勢。將CLIA檢測值依據RPR滴度不同分組進行多組獨立樣本秩和檢驗。以化學發光法檢測值為檢驗變量，以RPR滴度從陽性無滴度至1∶32的各種滴度為狀態變量進行ROC曲線分析和約登指數計算得出各種RPR滴度對應的CLIA臨界值。以RPR滴度為橫坐標，以CLIA檢測值為縱坐標繪制散點圖并根據散點圖擬合出CLIA最優曲線。所有數據采用SPSS25.0進行分析。

2 結果

2.1 經spearman相關分析RPR滴度與CLIA檢測值正相關，相關系數r=0.756，P<0.01。

2.2 經Kruskal-Wallis分析，以RPR滴度分組，CLIA檢測值在不同組間分布不完全相同(P<0.01)。

2.3 經ROC曲線分析及約登指數計算，將各RPR滴度對應的化學發光法對應臨界值匯總如下(見圖1～圖6及表1)，各臨界值具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 RPR陽性為治療標準的ROC曲線圖 圖2 RPR 1∶2為治療標準的ROC曲線圖 圖3 RPR 1∶4為治療標準的ROC曲線圖

圖4 RPR 1∶8為治療標準的ROC曲線圖 圖5 RPR 1∶16為治療標準的ROC曲線圖 圖6 RPR 1∶32為治療標準的ROC曲線圖

表1 各RPR滴度對應的CLIA臨界值

注：RPR滴度表示以大于及等于該滴度作為治療標準。

2.4 曲線擬合選取R2最高的曲線為三次曲線，R2=0.695，F=281.805,P<0.01(見圖7)。

圖7 CLIA檢測值與RPR的散點圖及擬合曲線

3 討論

梅毒作為一種傳染性疾病，可累及多個器官，比如梅毒性心血管病，多在感染后10～25年開始出現心血管的臨床癥狀和體征，診斷很困難。臨床可有單純性主動脈炎和繼發性主動脈瓣關閉不全、冠脈口狹窄及主動脈瘤等不同類型表現。梅毒性主動脈炎是梅毒性心血管病最常見的表現[3]。張曉榮等證實即使RPR檢查陰性，如果檢查發現有升主動脈增寬、主動脈瓣關閉不全、主動脈竇部增寬及冠狀動脈口狹窄的表現，提示可能潛在梅毒性損害[4]。梅毒眼部表現同樣呈現多樣化，超過1/3患者有持續的視力異常，患有乳頭炎和視網膜炎可增加持續性視功能障礙的風險[5]。有學者指出早期神經梅毒在原發感染后幾周到幾年中出現并進展，并且主要涉及腦膜。綜合征包括梅毒性腦膜炎(通常伴有顱神經病)，腦膜血管梅毒(伴有相關的缺血性中風)或無癥狀的神經梅毒。同時該學者還認為梅毒有助于HIV的傳播(反之亦然)，因此所有被診斷為梅毒的患者都應接受HIV檢測[6]。Novikov YA等認為在神經梅毒患者中，無論是否存在臨床癥狀，腦脊液中IL-23和IL-12p40的水平均顯著超過無神經系統特異性病變的患者[7]。梅毒還可引起膽管病變[8]、梅毒性肝炎[9]等。鑒于梅毒可引起多系統多器官的病變，中國疾病預防控制中心性病控制中心發布的梅毒感染診療指南中強調及早發現及治療后要經過足夠時間的追蹤觀察[10]。

RPR檢驗原理為梅毒螺旋體一旦感染人體，人體迅速對被損害的宿主細胞以及梅毒螺旋體細胞表面所釋放的類脂物質作出免疫應答，在3～4周產生抗類脂抗原的抗體(亦稱為反應素)。這些抗體主要是IgG和IgM型混合抗體。RPR的優勢在于價格低廉，操作簡單，抗原懸浮液穩定，15min內可完成檢測等。RPR的靈敏度取決于疾病階段，為73%～100%，特異性達98%[11]。血清稀釋按滴度判定，滴度越高，傳染性越強。

CLIA法是利用雙抗原夾心法化學發光免疫分析原理，采用梅毒螺旋體多種特異抗原包被固相發光微孔板，用辣根過氧化酶標記相同蛋白抗原作為標記抗原，與樣本中的梅毒螺旋體抗體形成雙抗原夾心復合物后，加入化學發光底物液，測定其發光值，根據閾值判定結果。CLIA操作自動化，敏感性根據疾病分期為82%～100%,特異性99%[11],敏感性和靈敏性均略勝于RPR。CLIA較RPR更利于檢測流程標準化，結果判定客觀性更強，更利于量化每個患者數據的縱向比較，對治療效果的判讀具有一致性，不受操作人員的影響，還可應用于大批量的檢測。

本次納入的樣本為根據PRP滴度選取，每個滴度選取標本量相對較平均，現實標本為低滴度的標本多于高滴度的標本，這和疾病本身分布以及治療后的血清固定有關。本次研究結果顯示CLIA和RPR呈正相關趨勢，兩者的相關系數為0.756，說明RPR滴度越高CLIA檢測值總體也越高，隨著RPR滴度的增加，CLIA的檢測值總體隨RPR增加呈增高的趨勢，同時兩者相關性較強。秩和檢驗顯示以RPR滴度分組比較CLIA檢測值在不同組間分布不全相同，因此，將CLIA檢測值作為RPR的替代具備一定可行性，但具體是否RPR和CLIA結果之間有一一對應的線性相關關系，進而可完全取代RPR滴度測定，還是只在某些區段呈線性相關則需要接下來的ROC曲線分析和擬合曲線等統計方法論證。

目前臨床治療梅毒主要有3種結果即臨床治愈、血清固定和無效。主要采用RPR滴度作為指標，RPR陽性則給予青霉素等藥物治療，臨床治愈指RPR轉為陰性，并且兩年內持續觀察RPR為陰性；如規范抗梅毒治療后RPR降低并維持在較低滴度不再下降且無其他癥狀則為血清固定，RPR滴度不變甚至增高則為無效，需要下1個療程的治療。

從本文的統計結果可以看出，RPR陽性對應的化學發光法臨界值為13.655。即CLIA檢測值高于13.655的患者可不再通過其他梅毒檢測進行確診，此前楊華等也曾報告以陽性預測值≥95%為目標，化學發光法篩查抗梅毒螺旋體抗體的復檢范圍S/Co比值設定為1.0～8.0，若S/Co比值≥8.1，可直接發出報告[12]。本文結果提示高于13.655表示需要給藥治療，或者已治療者排除了血清固定的情況下尚需要進入下1個療程，如果CLIA檢測值長時間持續低于13.655，表示已臨床治愈，不再需要抗生素治療。本文的統計結果中對應于RPR滴度1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32的CLIA法臨界值依次為15.320、19.100、17.945、20.055和18.615。可以看出，雖然CLIA法臨界值大體上呈隨RPR滴度上升而上升的趨勢，但在1∶8及1∶32兩個滴度對應的CLIA趨勢相反，雖然相反趨勢的變化幅度并不大，但對應不同RPR滴度的CLIA檢測值已有交叉，在未進行散點圖及曲線擬合情況下分析這一結果可能有兩個原因，一是RPR結果判定的主觀性影響，即對于相鄰結果的判定存在一定不確定性，這需要進一步加大納入樣本量甚至明確指定檢驗操作者來進一步分析這種結果的倒錯是否為主觀性影響；二是CLIA本身分布的類型問題，即CLIA檢測值和RPR滴度兩者間不是完全對應的線性相關。秩和檢驗后兩兩比較的結果也印證了這一點，并且這一推測在之后的曲線擬合中進一步得到了印證，從散點圖即可看出RPR滴度和CLIA檢測值之間并不是線性趨勢，擬合出的最優曲線為三次多項式曲線，即CLIA的分布為先升高之后下降后再上升，這和之前ROC曲線的結果相互對應，即在RPR滴度低于1∶4之前RPR滴度和CLIA檢測值之間變化趨勢相同，高于1∶4之后兩者趨勢變化不盡相同，即以CLIA檢測值分辨RPR滴度高于1∶4的樣本時存在困難，目前臨床上對于血清固定的認定基本不高于1∶8，但相對于更低滴度的血清固定來說，固定于1∶8的血清固定者較少，本文的CLIA法臨界值雖然如前述在1∶8上有所反復，但在RPR陽性至1∶4這一階段所對應的CLIA法S/Co值與RPR滴度正相關的趨勢較好，即在臨床應用中可滿足大部分血清固定者的判定。更為保守一點的判讀則可以將CLIA法S/Co值15.320以下，13.655以上的檢測值作為血清固定的判定指標，此外，本文中RPR更高滴度(高于1∶32)的病例數據尚且較少，有可能CLIA值和RPR值的曲線關系比三次多項式曲線更為復雜，未來可進一步收集高滴度病例以完善高滴度RPR與CLIA檢測值之間的對應關系。

綜上所述，CLIA檢測值與RPR滴度的對應關系為三次方曲線，CLIA檢測值總體隨RPR滴度增高有升高趨勢，但在某些滴度有部分倒錯。CLIA檢測值高于13.655可不需要其他檢測方法驗證而直接作為梅毒患者確診的指標，13.655也可作為給藥和停藥的指標，尚不能對RPR滴度始終高于1∶4的陽性患者的療效進行判斷，治療后CLIA值介于13.655和15.320之間的病例可認定為血清固定，CLIA方法在判斷滴度較低的血清固定病例有一定優勢。以CLIA檢測值完全取代RPR滴度作為療效觀察尚需更多的依據。