基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的安腸愈瘍湯治療潰瘍性結(jié)腸炎作用機制研究

樊靜娜

摘要：目的 ?基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討安腸愈瘍湯治療潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）的作用機制。方法 ?通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺構(gòu)建安腸愈瘍湯的潛在靶標(biāo)與UC疾病靶標(biāo)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。基于GO數(shù)據(jù)庫和KEGG通路數(shù)據(jù)庫進行基因功能和通路富集，采用Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建靶標(biāo)-信號通路網(wǎng)絡(luò)、藥物活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，采用熒光實時定量PCR對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要分析結(jié)果進行驗證。結(jié)果 ?分析結(jié)果表明，安腸愈瘍湯靶點主要關(guān)聯(lián)UC炎癥因子及免疫調(diào)控，糖類、脂質(zhì)和氨基酸代謝，能量代謝，神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)等;體外實驗提示，安腸愈瘍湯參與調(diào)控GCK、CROT介導(dǎo)的糖脂代謝，GNB1介導(dǎo)的炎癥通路，以及ATP1A1、COX7C介導(dǎo)的能量代謝、氧化磷酸化、線粒體電子呼吸鏈傳遞等通路。結(jié)論 ?安腸愈瘍湯治療UC具有多成分、多靶點的特點，可為進一步研究其作用機制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：安腸愈瘍湯;潰瘍性結(jié)腸炎;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用機制

中圖分類號：R259.746.2;R2-05 ???文獻標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2020）01-0092-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201902170

Study on Mechanism of AnchangYuyang Decoction in Treating Ulcerative ColitisBased on Network Pharmacology

FAN Jingna

First Clinical Medical School， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， China

Abstract： Objective To explore the mechanism of Anchang Yuyang Decoction in the treatment of ulcerative colitis （UC） based on network pharmacology. Methods The interaction network between UC targets and potential targets of Anchang Yuyang Decoction was constructed through Integrative Pharmacology-based Research Platform of TCM. Gene function and pathway enrichment were conducted based on GO database and KEGG pathway database. Cytoscape3.6.1 was used to construct target-signal pathway network and pharmaceutically active component-target network. The main results of network pharmacology were verified by real-time quantitative PCR. Results The results showed that the targets of Anchang Yuyang Decoction were mainly associated with inflammatory chemokines and immune system regulation in UC， carbohydrates， lipids and amino acid metabolism， energy metabolism， neuro-endocrine system regulation， etc. Vitro experiments indicated that Anchang Yuyang Decoction was involved in the regulation of glucose and lipid metabolism mediated by GCK and CROT， inflammatory pathway mediated by GNB1， as well as energy metabolism， oxidative phosphorylation， mitochondrial electron respiratory chain transmission mediated by ATP1A1 and COX7C. Conclusion AnchangYuyang Decoction applied for treating UC has the advantages of multi-components and targets， which can provide references for further research on mechanism.

Keywords： Anchang Yuyang Decoction; ulcerative colitis; network pharmacology; mechanism

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以結(jié)腸和直腸黏膜彌漫性炎癥為特征的慢性非特異性炎癥性腸病。本病臨床癥狀以發(fā)作、緩解交替出現(xiàn)為特點，易復(fù)發(fā)，且部分重癥患者病情重、變化快，藥物治療效果不佳。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對UC病因及發(fā)病機制未完全闡明，尚無針對其病因的特效藥物。中醫(yī)通過辨病與辨證相結(jié)合，抓住UC病機特點，隨證加減用藥，可顯著改善UC患者生活質(zhì)量，維持疾病臨床緩解，防治并發(fā)癥，并降低疾病復(fù)發(fā)率^[1]。

安腸愈瘍湯是導(dǎo)師遲莉麗教授經(jīng)多年臨床實踐總結(jié)的經(jīng)驗方，藥用黃芪、薏苡仁、白術(shù)、黃芩、黃連、木香、檳榔、地榆、當(dāng)歸、防風(fēng)、白芍、白及、甘草，共奏扶正補虛、解毒安腸之功。臨床和實驗研究表明，安腸愈瘍湯能顯著改善UC患者臨床癥狀，減少病情復(fù)發(fā)，具有較好的抗炎和促進潰瘍修復(fù)的作用^[2-5]。因此，深入探討安腸愈瘍湯的作用靶點，分析其可能的作用機制，對于闡述安腸愈瘍湯的科學(xué)內(nèi)涵具有重要作用。

中藥復(fù)方成分復(fù)雜，生物體生命活動規(guī)律的復(fù)雜性也限制了中藥現(xiàn)代研究的模式和方法。整合藥理學(xué)平臺在活性成分發(fā)現(xiàn)、作用分子機制闡釋、中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認等方面有良好的應(yīng)用前景，可通過整合中藥化學(xué)成分、疾病靶標(biāo)構(gòu)建“化學(xué)成分-作用靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)”^[6]，可從分子層面較好闡釋中藥方劑的作用機制。因此，本研究借助整合藥理學(xué)平臺，探討安腸愈瘍湯治療UC的可能作用機制，以期為安腸愈瘍湯的深入研究提供依據(jù)。

1? 資料與方法

1.1? 復(fù)方中藥成分及靶標(biāo)檢索

中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（http：//www.tcmip.cn/）中藥材數(shù)據(jù)庫依據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》，收錄400余味常用中藥材。通過該平臺逐一錄入安腸愈瘍湯各單味藥名稱，收集藥物所有化學(xué)成分，建立安腸愈瘍湯的化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫，包括化合物編號、中英文名稱、分子式等。

1.2? 候選疾病靶標(biāo)來源

在中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺疾病/癥狀靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫中，以“colitis”“ulcerative”“IBD”作為疾病關(guān)鍵詞進行搜索，選取檢索出的藥物靶標(biāo)基因、靶標(biāo)蛋白等相關(guān)信息作為藥物候選靶標(biāo)來源。

1.3? 靶標(biāo)預(yù)測

通過OpenBabel軟件并應(yīng)用MACCS（molecular access system）分子指紋技術(shù)提取藥物化學(xué)成分，對安腸愈瘍湯中化學(xué)成分二維結(jié)構(gòu)（.mol）與Drug Bank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/）中的藥物進行化學(xué)指紋特征比對，以Tanimoto系數(shù)定義的相似度計量方法進行相似性打分，取分數(shù)>0.8的藥物靶標(biāo)為安腸愈瘍湯作用的潛在靶標(biāo)。

1.4? 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息

中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺鑲嵌了HAPPI、Reactome、OPHID、In Act、HPRD、PDZBase、MINT、DIP等數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）數(shù)據(jù)。通過該平臺的PPI數(shù)據(jù)庫，可直接獲得安腸愈瘍湯作用的潛在靶標(biāo)與UC疾病靶標(biāo)之間的PPI信息。

1.5? 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺，針對安腸愈瘍湯作用的潛在靶標(biāo)與UC疾病靶標(biāo)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，以節(jié)點連接度的2倍中位數(shù)為卡值，選取中藥靶標(biāo)-疾病基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點，同時選取滿足節(jié)點連接度（degree）、節(jié)點緊密度（closeness）和節(jié)點介度（betweenness）中位數(shù)的節(jié)點，構(gòu)建安腸愈瘍湯的潛在靶標(biāo)與UC疾病靶標(biāo)之間相互作用的關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.6? 基因功能和通路富集分析

中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺基于GO數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology，http：//www.geneontology.org/）和KEGG通路數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http：//www.genome.jp/kegg/）資源，確定靶標(biāo)基因、蛋白質(zhì)分子功能、細胞內(nèi)定位，及其所參與的生物學(xué)反應(yīng)和通路，結(jié)合富集計算，得出安腸愈瘍湯的直接作用靶標(biāo)和UC疾病的核心靶標(biāo)，進行基因功能分析和通路分析，并將所得結(jié)果按P值降序排列，選取P值前20位的通路，構(gòu)建“中藥方劑-中藥材-化學(xué)成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”的多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。借助Cytoscape3.6.1（http：//www.cytoscape.org）軟件構(gòu)建疾病靶標(biāo)-信號通路網(wǎng)絡(luò)、藥物活性成分-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.7? 體外驗證實驗

1.7.1? 細胞與試藥

人結(jié)直腸腺癌HT-29細胞，中喬新舟有限公司。DMEM培養(yǎng)基（貨號10-013-CVR），CORNING公司;胎牛血清（FBS），LONSERA公司;青霉素-鏈霉素（P/S），HyClone公司;脂多糖（LPS），Sigma公司;TB Green Premix Ex Taq PCR試劑盒，TAKARA公司。安腸愈瘍湯，購自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，取1劑，經(jīng)水提、蒸發(fā)、濃縮至不流動的清膏，使用時稱取適量，溶解，過0.22 μm濾膜除菌后于-20 ℃保存。

1.7.2? 細胞培養(yǎng)及分組干預(yù)

HT-29細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS、1%P/S），37 ℃、5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞貼壁后取對數(shù)生長期細胞，分為3組。對照組：加入不含F(xiàn)BS、P/S的DMEM中孵育24 h;模型組：予LPS（20 μg/mL）孵育24 h^[7];實驗組：根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，在模型組干預(yù)基礎(chǔ)上予安腸愈瘍湯1 mg/mL孵育24 h。

1.7.3? 檢測指標(biāo)及方法

Trizol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)試劑盒說明書進行熒光實時定量PCR檢測。預(yù)變性引物見表1。

1.7.4? 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 藥物化學(xué)成分靶標(biāo)預(yù)測及分析

通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺收集安腸愈瘍湯13味中藥共591種化學(xué)成分，通過與Drug Bank數(shù)據(jù)庫中的藥物進行比對，相似性分數(shù)≥0.8的靶標(biāo)共3405個。各單味藥兩兩之間的共有靶標(biāo)，除甘草外，黃芪、黃芩、檳榔、當(dāng)歸、木香、白術(shù)、白芍、防風(fēng)與其他藥味間的共有靶標(biāo)均大于100個。

對安腸愈瘍湯候選靶標(biāo)進行基因分析，取P值排名前20位，得到候選靶標(biāo)的基因功能，涉及離子性谷氨酸受體信號通路、線粒體基質(zhì)、蛋白質(zhì)翻譯的tRNA氨酰化、線粒體內(nèi)膜、氧化還原過程、氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運活動、鳥氨酸循環(huán)、細胞色素C氧化酶活性、線粒體電子傳遞等。對安腸愈瘍湯候選靶標(biāo)進行通路富集分析，取P值排名前20位，得到候選靶標(biāo)參與的通路信息，主要涉及谷氨酸能突觸、氨基酸代謝、氨酰化tRNA的合成、精氨酸和脯氨酸代謝、丙氨酸、谷氨酸代謝、輔酶因子和維生素的代謝、能量代謝等通路。

2.2? 基因功能和通路富集分析

通過GO數(shù)據(jù)庫分析，安腸愈瘍湯藥物靶標(biāo)與UC疾病靶標(biāo)基因功能有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、炎癥反應(yīng)、老化、化學(xué)突觸傳遞、腺苷酸環(huán)素-G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、激活蛋白激酶A活性、胞質(zhì)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)、MAPK級聯(lián)反應(yīng)、環(huán)磷酸腺苷的合成、缺氧反應(yīng)、離子性谷氨酸受體信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子受體信號通路、線粒體ATP合成質(zhì)子傳輸?shù)葪l目，見表2。

通過KEGG數(shù)據(jù)庫富集安腸愈瘍湯治療UC關(guān)鍵靶標(biāo)所參與的通路主要涉及趨化因子信號通路、嘌呤代謝、核苷酸代謝、神經(jīng)系統(tǒng)、核糖體、內(nèi)分泌系統(tǒng)、谷氨酸能突觸、膽堿能突觸、ErbB信號通路等，見表3。

2.3? 中藥成分-靶標(biāo)-通路多維網(wǎng)絡(luò)分析

基于PPI數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建安腸愈瘍湯潛在藥物靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)條件篩選出關(guān)鍵靶標(biāo)184個（見圖1），圖中節(jié)點大小與degree值成正比，其中疾病靶標(biāo)主要有CCR9（趨化因子受體9）、IKBKB（IKKβ，NF-κB激酶亞單位β抑制劑）、HPRT1（次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）等，藥物靶標(biāo)主要有CROT（肉毒堿酰基轉(zhuǎn)移酶）、GCK（葡萄糖激酶）、ATP1A1和ATP5C1（鈉/鉀轉(zhuǎn)運ATP酶）、COX7C和COX5B（細胞色素C氧化酶）、EPRS（雙功能氨酰-tRNA合成酶），這些藥物靶標(biāo)主要涉及能量代謝、單核細胞和巨噬細胞的調(diào)控、脂肪酸及糖類代謝等。疾病靶標(biāo)-信號通路網(wǎng)絡(luò)見圖2，疾病靶標(biāo)-藥物活性成分網(wǎng)絡(luò)見圖3。大部分靶標(biāo)及富集通路主要涉及能量代謝、炎癥趨化因子及免疫系統(tǒng)的調(diào)控、糖類、脂肪酸及氨基酸的代謝等。篩選核心節(jié)點前10位的疾病靶標(biāo)，構(gòu)建疾病靶標(biāo)與活性化合物的網(wǎng)絡(luò)，其中共有活性化合物136種，安腸愈瘍湯中與疾病靶標(biāo)關(guān)系密切的藥物主要為黃芪、黃芩、地榆、甘草、檳榔，藥物及其所含活性化合物數(shù)量依次為：黃芩（32）、地榆（31）、甘草（28）、黃芪（19）、檳榔（12）、白芍（7）、當(dāng)歸（3）、防風(fēng)（3）、白術(shù)（2）、木香（2）、黃連（1），其中黃芪皂苷、三萜類的鞣質(zhì)、地榆皂苷、甘草皂苷、黃酮類物質(zhì)、黃芩素、氨基酸等在活性成分中占主要比例。

2.4? 安腸愈瘍湯對LPS誘導(dǎo)的HT-29細胞GCK、CROT、ATP1A1、GNB1、ATP5C1、COX7C mRNA的影響

LPS作用24 h，GCK、CROT、GNB1表達下調(diào)，ATP1A1、COX7C表達上調(diào)（P<0.05），表明LPS可誘導(dǎo)活化各基因;安腸愈瘍湯干預(yù)后，GCK、CROT、ATP1A1、GNB1 mRNA表達升高（P<0.05），COX7C mRNA表達受到抑制（P<0.05）。ATP5C1 mRNA表達未見明顯變化。見表4。

3? 討論

UC屬中醫(yī)學(xué)“休息痢”“腸澼”“腸風(fēng)”范疇，多因感受外邪，飲食不節(jié)，損傷脾運，或素體稟賦不足，情志內(nèi)傷，脾虛運化失職，濕濁內(nèi)生，積聚日久化為濕熱濁毒，蘊結(jié)腸腑，氣血凝滯，損傷腸膜脂絡(luò)而致。遲莉麗教授認為，虛、毒、瘀是UC的基本病機，以脾胃虛損為本，毒損腸絡(luò)、腸絡(luò)瘀阻為標(biāo)，據(jù)此擬方安腸愈瘍湯，健脾益氣以扶正，祛濕解毒以祛邪，標(biāo)本兼顧，共奏扶正補虛、解毒安腸之功，適用于UC脾虛毒戀證。實驗研究表明，安腸愈瘍湯可通過調(diào)控腫瘤壞死因子-α、白細胞介素（IL）-8等炎癥因子釋放及抑制核因子-κB通路等，減弱炎癥級聯(lián)反應(yīng)并促進三葉因子3、黏蛋白2等促進黏膜修復(fù)^[8-9]。臨床研究顯示，安腸愈瘍湯能顯著改善UC患者臨床癥狀，減少病情復(fù)發(fā)，具有較好的抗炎和促進潰瘍修復(fù)的作用^[2-5]。

本研究通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺收集安腸愈瘍湯中13味中藥化學(xué)成分和靶標(biāo)，結(jié)果顯示，每味中藥可作用于多個靶標(biāo)，多種中藥可同時作用于一個靶點，說明藥物間發(fā)揮作用有著密切的關(guān)系，各藥相須相使相輔相成。對基因功能和通路富集的分析顯示，安腸愈瘍湯對UC的干預(yù)作用主要涉及炎癥因子趨化，氨基酸、脂質(zhì)代謝，神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，能量代謝等。通過構(gòu)建安腸愈瘍湯潛在藥物靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選出關(guān)鍵靶標(biāo)184個，其中疾病靶標(biāo)主要有CCR9、IKBKB、HPRT1，藥物靶標(biāo)主要有CROT、GCK、ATP1A1、ATP5C1、COX7C、COX5B、EPRS。通過構(gòu)建疾病靶標(biāo)-信號通路網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)大部分靶標(biāo)及富集通路主要涉及能量代謝、炎癥趨化因子及免疫系統(tǒng)的調(diào)控、糖類、脂肪酸及氨基酸的代謝等。UC在氨基酸代謝、脂類代謝、糖代謝等生理過程可能存在一定的紊亂。王敦方等^[10]利用超高液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)觀察黃芩湯對UC大鼠血清代謝譜的變化，發(fā)現(xiàn)UC模型大鼠能量代謝涉及的乳酸、肌酸，膽堿代謝產(chǎn)物如三甲胺，脂類代謝產(chǎn)物如棕櫚酸等均出現(xiàn)異常，應(yīng)用黃芩湯干預(yù)后有趨向于正常水平的趨勢，尤其是纈氨酸、色氨酸、乳酸、尿素等物質(zhì)代謝最為突出。本研究預(yù)測結(jié)果與文獻報道相符，提示應(yīng)重視氨基酸代謝、脂類代謝、糖代謝在UC中的重要作用。篩選核心節(jié)點前10位的疾病靶標(biāo)，構(gòu)建疾病靶標(biāo)與活性化合物的網(wǎng)絡(luò)，共有136種活性成分，安腸愈瘍湯中與疾病靶標(biāo)關(guān)系密切的藥物主要為黃芪、黃芩、地榆、甘草、檳榔，其中黃芪皂苷、三萜類的鞣質(zhì)、地榆皂苷、甘草皂苷、黃酮類物質(zhì)、黃芩素、氨基酸等活性成分占主要比例。研究表明，黃芪多糖可調(diào)節(jié)UC大鼠血清炎癥因子IL-4、IL-5、IL-13含量，調(diào)節(jié)IL-27和干擾素-γ，抑制Th17細胞分化，調(diào)節(jié)免疫平衡^[11-12]。甘草酸二胺具有與皮質(zhì)類固醇類似的非特異抗炎作用，原皓等^[13]研究認為可能是通過上調(diào)外周血單個核細胞中Foxp3 mRNA的表達，抑制自身反應(yīng)性淋巴細胞增殖，從而減輕炎癥反應(yīng)。黃芩苷可通過調(diào)節(jié)p-STAT4/STAT4、p-STAT6/STAT6及相關(guān)細胞因子調(diào)節(jié)免疫平衡，緩解UC炎癥反應(yīng)^[14]。

采用安腸愈瘍湯干預(yù)脂多糖誘導(dǎo)的HT-29細胞炎癥模型驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)安腸愈瘍湯可顯著上調(diào)GCK、CROT、ATP1A1、GNB1表達。GCK上調(diào)可提高細胞內(nèi)糖類代謝水平，提高糖酵解效率。ATP1A1水平升高可提高細胞內(nèi)能量代謝，增加細胞供能。CROT是細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝中產(chǎn)生脂肪酰輔酶A重要的催化酶^[15-16]，其上調(diào)表明細胞內(nèi)脂肪酸氧化代謝增強，與預(yù)測安腸愈瘍湯參與調(diào)控糖類、脂肪酸代謝相吻合。GNB1參與炎癥趨化因子調(diào)節(jié)通路，是JAK/STAT、MAPK等信號通路的重要啟動蛋白，研究發(fā)現(xiàn)GNB1介導(dǎo)Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并促進核因子-κB的活化^[17]。COX7C在新陳代謝、氧化磷酸化、線粒體電子呼吸鏈的傳遞中發(fā)揮重要作用，可能與GCK、ATP1A1共同參與細胞內(nèi)的能量代謝調(diào)節(jié)過程。體外驗證實驗在一定程度上證實了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，采用整合藥理學(xué)平臺，建立了安腸愈瘍湯成分靶標(biāo)-潰瘍性結(jié)腸炎靶標(biāo)的分子生物網(wǎng)絡(luò)、復(fù)方中藥-成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)，從多個角度探索安腸愈瘍湯治療UC的潛在分子機制。結(jié)果表明，安腸愈瘍湯可通過調(diào)控能量代謝，炎癥趨化因子及免疫系統(tǒng)，糖類、脂肪酸及氨基酸的代謝等多靶點、多途徑發(fā)揮治療UC的作用，其具體機制及物質(zhì)基礎(chǔ)還需通過更深入的實驗研究加以驗證。

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（收稿日期：2019-02-21）

（修回日期：2019-03-23;編輯：陳靜）