肝癌組織Mortalin表達水平對術后復發的影響

林燁玨 唐成武 費卯云

[摘要] 目的 探討肝癌組織中Mortalin表達水平對術后復發的影響。 方法 回顧性分析2010年5月～2015年10月間在本院接受手術治療的150例肝細胞肝癌患者的臨床資料。Western blot 法檢測肝癌標本內的Mortalin表達水平，采用ROC曲線和Kaplan-Meier法分析Mortalin表達水平對肝癌術后復發的影響。 結果 肝癌組織Mortalin表達水平對術后復發預測的曲線下面積（AUC）為0.852，特異度為86.75%，靈敏度為85.07%，最佳判讀值為2.14（P<0.01）。根據ROC曲線分析結果，將肝癌組織Mortalin相對表達水平>2.14的患者納入高表達組（n=69），而肝癌組織Mortalin相對表達水平<2.14的患者納入低表達組（n=81）。Kaplan-Meier法生存分析發現高表達組術后3年內有57例患者出現復發（3年無復發生存率為17.39%）;低表達組術后3年內有10例患者出現復發（3年無復發生存率為87.65%），低表達組3年無復發生存率明顯優于高表達組（P<0.01，兩組間復發風險比：10.9915， 95%可信區間：6.6338～18.2119）。 結論 肝癌組織Mortalin表達水平與肝癌術后復發顯著相關，Mortalin表達水平升高則預示著術后早期復發，預后不佳。

[關鍵詞] 肝細胞癌;表達;肝切除;復發;Mortalin

[中圖分類號] R735.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）05-0009-04

Effect of Mortalin expression level on postoperative recurrence in hepatocellular carcinoma

LIN Yejue? ?TANG Chengwu? ?FEI Maoyun

Department of Surgery， the First People's Hospital Affiliated to Huzhou University， Huzhou? ?313000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Mortalin expression level on postoperative recurrence in hepatocellular carcinoma. Methods The clinical data of 150 patients with hepatocellular carcinoma who underwent surgery in our hospital from May 2010 to October 2015 were retrospectively analyzed. The expression of Mortalin in liver cancer specimens was detected by Western blot. The effect of Mortalin expression on the recurrence of liver cancer was analyzed by ROC curve and Kaplan-Meier method. Results The area under the curve （AUC） of Mortalin expression in hepatocarcinoma was 0.852， the specificity was 86.75%， the sensitivity was 85.07%， and the best interpretation was 2.14（P<0.01）. According to the results of ROC curve analysis， patients with liver cancer tissue Mortalin relative expression level greater than 2.14 were included in the high expression group （n=69）， while those with liver cancer tissue Mortalin relative expression level less than 2.14 were included in the low expression group（n=81）. Kaplan-Meier survival analysis showed that 57 patients in the high expression group had recurrence within 3 years after operation（3 years recurrence-free survival rate was 17.39%）; 10 patients had recurrence within 3 years after operation in low-expression group （3 years recurrence-free survival rate was 87.65%）. The 3-year recurrence-free survival rate of the low-expression group was significantly better than that of the high-expression group（P<0.01， the risk ratio of recurrence between the two groups：10.9915， 95% confidence interval： 6.6338-18.2119）. Conclusion The expression level of Mortalin in hepatocellular carcinoma is significantly correlated with postoperative recurrence of liver cancer.The increased expression of Mortalin predicts early recurrence and poor prognosis.

[Key words] Hepatocellular carcinoma; Expression; Hepatectomy; Recurrence; Mortalin

肝癌是我國目前發病率第三的腫瘤，而其致死率位列第二，已經成為嚴重危害國民健康的公共衛生難題[1-3]。手術切除目前是除肝移植之外針對肝癌最有效的治療手段[4]。然而肝癌手術切除后仍有非常高的復發率，導致長期生存率不甚理想，給家庭社會帶來巨大的精神損失和壓力[5，6]。因此需要深入探索肝癌術后復發的機制及危險因素，并找到預防術后復發的治療策略及靶點，以改善肝癌術后長期生存。Mortalin是熱休克蛋白70族蛋白的一種，又被稱作GRP75，最早是在小鼠胚胎成纖維細胞中發現，廣泛存在細胞器內，具有調節細胞分化及腫瘤發生等作用[7-10]。本研究旨在探討肝細胞癌組織中Mortalin表達水平對肝癌術后復發的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性研究2010年5月～2015年5月間在本院接受手術治療的150例肝細胞肝癌患者，入組標準[11]：年齡75歲以下;無全身轉移;術后生存期>6個月;隨訪資料完整;均簽署治療知情同意書。排除標準：血液系統疾病;術后生存期<6個月。在所有入組的患者中男113例、女37例，平均年齡（56.09±6.68）歲，其中102例接受腹腔鏡肝癌根治術，48例接受開放肝癌根治術，平均術前甲胎蛋白（AFP）水平為（453.42±75.59）ng/mL。

1.2 肝癌組織Mortalin表達水平檢測

取標本庫中對應患者手術組織標本，按照蛋白提取試劑盒的說明書，制備蛋白標本，BCA法測蛋白濃度。取20 μL樣品上樣，使用SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，半干式電轉膜儀轉移蛋白至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉，Mortalin一抗孵育過夜，β-actin二抗室溫孵育2 h。ECL顯影和定影。Mortalin蛋白大小為74 ku;β-actin蛋白大小為43 ku。Mortalin相對含量=Mortalin灰度值/β-actin灰度值。

1.3 隨訪及觀察指標

所有患者均接受術后定期隨訪（術后半年內每個月1次，其后每3個月1次），收集患者資料，包括3年內復發情況及復發時間。

1.4 統計學方法

計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗;計數資料采用χ2檢驗;Mortalin表達對術后復發的預測作用采用ROC曲線分析;患者生存資料采用Kaplan-Meier法分析。所有統計均由MEDCALC15.2軟件完成，P<0.05表示有統計學差異。

2 結果

2.1 肝癌組織Mortalin表達水平對肝癌術后復發的預測價值

運用MEDCALC15.2軟件將患者復發情況（無復發=0，復發=1）與肝癌組織Mortalin表達水平繪制ROC曲線（圖1），測得Mortalin表達水平對術后復發預測的曲線下面積（AUC）為0.852，特異度為86.75%，靈敏度為85.07%，最佳判讀值為2.14（P<0.01）。

2.2 肝癌組織Mortalin表達對術后復發的影響

根據上述ROC曲線分析結果（最佳判讀值為2.14），將肝癌組織Mortalin相對表達水平>2.14的患者納入高表達組（n=69），而將肝癌組織Mortalin相對表達水平<2.14的患者納入低表達組（n=81）。兩組患者的一般資料在年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤數量、手術方式、病毒感染及有無接受術后化療等方面無顯著差異（P>0.05）（表1）。高表達組術后3年內有57例患者出現復發（3年無復發生存率為17.39%）;低表達組術后3年內有10例患者出現復發（3年無復發生存率為87.65%）。Kaplan-Meier法生存分析發現低表達組3年無復發生存率明顯優于高表達組（P<0.01，兩組間復發風險比：10.9915，95%可信區間：6.6338～18.2119）（圖2）。

3 討論

肝癌是我國目前最常見的惡性腫瘤之一，在我國肝癌的發病率約為26.63/10萬，每年死于肝癌的人數約為31.6萬，占據全世界肝癌死亡人數的一半以上[1]。手術切除是除肝移植之外針對肝癌目前最有效的治療手段[4]。然而肝癌手術切除后仍有非常高的復發率，導致長期生存率不甚理想，給家庭社會帶來巨大的精神損失和壓力[5，6]。因此需要深入探索肝癌術后復發的機制及危險因素，找到預防術后復發的靶點，以改善肝癌術后長期生存。

隨著分子生物學及人類基因組學等基礎科學的發展，越來越多的腫瘤分子標記物被發現。Mortalin是熱休克蛋白70族蛋白的一種，又被稱作GRP75，最早是在小鼠胚胎成纖維細胞中發現，廣泛存在細胞器內。Mortalin已被證實在肺癌、胰腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤內表達上調，且其表達水平直接與預后相關，已成為腫瘤預后的重要預測因子[12-15]。同時，Mortalin還被發現在多種腫瘤中起到介導化療耐藥、抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤早期復發轉移等作用，因此Mortalin過表達使得腫瘤預后進一步惡化[16-20]。

近年來關于Mortalin在肝癌發生發展中的作用機制研究日漸受到重視。有學者利用蛋白組學對攜有丙肝病毒的肝癌患者的肝癌組織進行檢測，結果發現在此類肝癌組織中Mortalin的表達較正常肝組織增高[21]。為研究肝癌組織Mortalin表達與復發的關系，有研究者將術后1年內早期復發的肝癌患者肝癌Mortalin表達水平與1年后復發的患者比較，發現在肝癌術后1年內早期復發的患者Mortalin表達水平要顯著高于1年后復發的患者，同時還發現在轉移性肝癌細胞系中其表達亦升高。從而提示Mortalin在肝癌復發轉移等方面可能發揮重要作用，與腫瘤侵襲密切相關[22]。

本研究通過ROC曲線分析發現，肝癌組織Mortalin表達水平對術后復發預測的AUC為0.852，特異度為86.75%，靈敏度為85.07%，最佳判讀值為2.14（P<0.01）。根據ROC曲線分析結果，將患者按肝癌組織Mortalin表達水平分類為高表達組和低表達組，Kaplan-Meier法生存分析發現低表達組3年無復發生存率明顯優于高表達組（P<0.01）。

有學者發現Mortalin基因表達量與肝癌細胞增殖基因、間質-上皮轉變（Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）相關基因直接相關[23，24]。而通過放療聯合局部熱療可有效降低Mortalin基因表達量，從而抑制肝細胞增殖及EMT，改善患者預后[25]。這可能是由于EMT是腫瘤侵襲轉移級聯反應的第一步，腫瘤上皮細胞失去細胞間連接（基地極性）并獲得遷移、侵襲基底膜的能力[26]。眾多惡性腫瘤研究已經證實，細胞發生EMT后失去上皮標志蛋白并獲得間質標志蛋白，導致其黏著連接破壞并出現局部或者遠處轉移[27]。EMT參與惡性腫瘤細胞血管滲出、腫瘤轉移定植等眾多過程，EMT活性與腫瘤惡性程度高度相關[28]。我們可以推測通過降低Mortalin水平抑制肝癌細胞EMT能顯著改善肝癌預后。綜上所述，肝癌組織Mortalin表達水平與肝癌術后復發顯著相關，Mortalin表達水平升高則預示著術后早期復發，預后不佳，因此Mortalin可能是預防肝癌術后復發的有效治療靶點。

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（收稿日期：2019-09-06）