高遷移率族蛋白1在醛固酮誘導腎小管上皮細胞自噬中的作用

毛楠，林定彪，馬欣，陳鴻禧，周琬秋，王少清△

慢性腎臟病（chronic kidney disease,CKD）是威脅人類健康的重大疾病之一，已經成為全球性公共健康問題，其發病率、致殘率和病死率高，給個人、家庭及社會造成極大的經濟負擔。醛固酮（aldosterone，ALDO）是CKD進展的一個關鍵遞質，直接參與腎小管損傷及腎臟纖維化的發生和發展。筆者既往研究發現，ALDO可促進大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的釋放，通過AMPK/mTOR信號通路誘導NRK-52E細胞發生自噬［1］。大量研究證實，高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）與細胞自噬存在密切的關系［2］。HMGB1作為一種新型的炎性細胞因子，廣泛分布于淋巴組織、心、肝、肺、脾、腎、腦等組織中，其本身很少或者無促炎癥活性，但當它與炎癥介質結合時，可激活和趨化炎癥細胞，誘導大量炎癥因子的分泌和釋放，進而激發一系列炎癥反應［3］。筆者推測HMGB1可能是ALDO誘導NRK-52E細胞自噬的重要中介因素。本研究擬采用ALDO致腎小管上皮細胞損傷模型，探討HMGB1在ALDO誘導NRK-52E細胞自噬中的作用，為慢性腎臟病的防治提供新靶點和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）購自中科院干細胞庫/干細胞技術平臺，課題組既往研究已驗證該細胞的生物學特性［1］。

1.1.2 藥物與試劑 醛固酮、N-乙酰半胱氨酸（美國Sigma公司）；DMEM培養基、10%胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；兔抗大鼠白細胞介素（IL）-1β多克隆抗體、兔抗大鼠LC3B多克隆抗體、兔抗大鼠Beclin-1多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（美國CST公司）；兔抗HMGB1多克隆抗體，兔抗p62多克隆抗體（英國Abcam公司）；兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）活性氧熒光探針試劑盒（上海碧云天生物有限公司）。

1.1.3 主要儀器 細胞培養箱（美國Thermo公司）；無菌操作臺（德國Heraeus公司）；流式細胞儀（FACSAria，美國BD Bioscience公司）；冷凍離心機（德國SORVALL-fresco公司）；高速低溫臺式離心機（德國Heraeus公司）；垂直/水平電泳槽（上海天能）；水平電泳儀、Trans-blot電轉移槽、圖像采集與分析儀（美國Bio-rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 將正常大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，細胞于37℃、5%CO2培養箱中培養，每2～3 d傳代1次，待細胞融合至80%時，改為無血清DMEM培養基饑餓24 h，使其生長同步化后進行以下實驗。

1.2.2 ROS檢測 將密度為1.0×105個/孔的NRK-52E細胞接種在6孔板中過夜，分為Control組、ALDO組（加入ALDO 10 nmol/L）、HMGB1抗體組（加入1 mg/L HMGB1）、IgG組（加入1 mg/L IgG）、ALDO+HMGB1抗體組（1 mg/L HMGB1抗體預處理1 h，再加入10 nmol/L ALDO）和陽性對照組（加入活性氧供氫體Rosup100μmol/L），以上各組均干預24 h，每組3個復孔。取10μL DCFH-DA探針，用20 mL無血清培養液稀釋DCFH-DA探針，使其終濃度為5μmol/L。收集上述各組干預24 h后的細胞，懸浮于1 mL稀釋好的DCFH-DA中，37℃細胞培養箱內孵育30 min（每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸）；用無血清DMEM細胞培養基洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA；應用流式細胞儀488 nm激發波長，525 nm發射波長檢測NRK-52E細胞的ROS水平。細胞內的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的2'，7'-二氯熒光素（2',7'-Dichlorofluorescein,DCF），綠色熒光強度與細胞內ROS水平成正比，即細胞內ROS水平=DCF熒光強度。

1.2.3 Western blot檢測IL-1β蛋白的表達 此部分實驗設Control組、ALDO組（加入10 nmol/L ALDO）、NAC組（加入50μmol/L NAC）、NAC+ALDO組（50μmol/L NAC預處理NRK-52E細胞1 h后，再加入10 nmol/L ALDO），各組均干預24 h，每組3個復孔。收集各實驗組細胞后提取蛋白，BCA法測蛋白濃度。將40μg總蛋白提取液與4×SDS緩沖液混勻，100℃加熱變性8 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入兔抗大鼠IL-1β多克隆抗體（1∶1 000），4℃過夜；TBST緩沖液漂洗8 min×3次；加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（1∶6 000），37℃孵育2 h，TBST緩沖液清洗5 min×3次，避光加入ECL發光劑，X線常規顯影、定影并進行灰度分析。

1.2.4 ALDO對NRK-52E細胞HMGB1蛋白表達的影響 取對數生長期的NRK-52E細胞，分為Control組和ALDO組（10 nmol/L），干預24 h后提取蛋白，BCA法測蛋白濃度。將40μg總蛋白提取液與4×SDS緩沖液混勻，100℃加熱變性8 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入兔抗HMGB1多克隆抗體（1∶1 000），4℃過夜；TBST緩沖液漂洗8 min×3次；加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（1∶6 000），37℃孵育2 h，TBST緩沖液清洗5 min×3次，避光加入ECL發光劑，X線常規顯影、定影并進行灰度分析。

1.2.5 阻斷HMGB1對ALDO誘導NRK-52E細胞自噬的影響 此部分實驗設為Control組、ALDO組（加入10 nmol/L ALDO）、HMGB1抗體組（加入1 mg/L HMGB1抗體）和ALDO+HMGB1抗體組（1 mg/L HMGB1抗體預處理1 h后，再加入10 nmol/L ALDO），各組均干預24 h，參照1.2.4中的步驟，Western blot法檢測LC3-Ⅱ、Beclin-1和p62蛋白的表達。

1.3 統計學方法 實驗重復3次，所有結果均采用SPSS 22.0統計軟件處理，計量資料用x±s表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，獨立的多樣本均數的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，兩因素水平的樣本均數比較采用析因方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 醛固酮可誘導NRK-52E細胞內ROS產生增加 流式細胞儀檢測結果顯示，與Control組比較，ALDO組、ALDO+HMGB1抗體組和Rosup組ROS水平明顯升高（P＜0.05）；與ALDO組比較，HMGB1抗體組、IgG組和ALDO+HMGB1抗體組ROS水平顯著降低（P＜0.05），Rosup組ROS水平升高（P＜0.05）；與HMGB1抗體組比較，ALDO+HMGB1抗體組和Rosup組ROS水平升高（P＜0.05）；與IgG組比較，ALDO+HMGB1抗體組和Rosup組ROS水平升高（P＜0.05）；與Rosup組比較，ALDO+HMGB1抗體組ROS水平降低（P＜0.05）；Control組、HMGB1抗體組和IgG組組間兩兩比較差異無統計學意義。即ROS水平：Rosup組＞ALDO組＞ALDO+HMGB1抗體組＞HMGB1抗體組/Control組/IgG組，見表1、圖1。

Tab.1 Effects of different intervention conditions on ROS levels in NRK-52E cells表1 各組不同干預條件對NRK-52E細胞內ROS水平的影響 （x±s）

Fig.1 Effects of different intervention conditions on ROS level in NRK-52E cells圖1 各組不同干預條件對NRK-52E細胞內ROS水平的影響

2.2 ALDO對NRK-52E細胞IL-1β蛋白表達的影響 由表2析因方差分析結果可得，PALDO＜0.05，即ALDO可上調IL-1β蛋白的表達；PNAC＞0.05，即NAC對 IL-1β 蛋白的表達無影響；PALDO×NAC＜0.05，即ALDO與NAC兩因素間存在交互作用，且對IL-1β蛋白表達有抑制作用，見表2、圖2。

Tab.2 Effects of aldosterone on the expression of IL-1β in NRK-52E cells表2ALDO對NRK-52E細胞IL-1β蛋白表達的影響（n=3，x±s）

Fig.2 Effects of aldosterone on the expression of IL-1β protein in NRK-52E cells圖2 ALDO對NRK-52E細胞IL-1β表達的影響

2.3 ALDO對NRK-52E細胞HMGB1蛋白表達的影響 與Control組（0.33±0.13）比較，ALDO組（0.56±0.05）HMGB1蛋白的表達上調（n=3，t=2.841，P＜0.05），見圖3。

Fig.3 Effects of aldosterone on HMGB1 protein expression in NRK-52E cells圖3ALDO對NRK-52E細胞HMGB1表達的影響

2.4 阻斷HMGB1改善ALDO誘導的NRK-52E細胞自噬 Western blot結果顯示，與Control組比較，ALDO組LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達上調，p62蛋白表達下調（P＜0.05）。與ALDO組比較，ALDO+HMGB1抗體組LC3-Ⅱ蛋白表達降低、p62蛋白表達增加（P＜0.05），Beclin-1蛋白的表達差異無統計學意義。與HMGB1組相比，ALDO+HMGB1抗體組Beclin-1蛋白的表達增加（P＜0.05）。在Control組、HMGB1抗體組、ALDO+HMGB1抗體組間LC3-Ⅱ、p62蛋白表達差異無統計學意義；Control組、HMGB1抗體組間Beclin-1蛋白表達差異無統計學意義，見表3、圖4。

Tab.3 Effects of HMGB1 blocking on ALDO-induced autophagy of NRK-52E cells表3 阻斷HMGB1對ALDO誘導NRK-52E細胞自噬的影響 （n=3，x±s）

Fig.4 Effects of HMGB1 blocking on ALDO-induced autophagy of NRK-52E cells圖4 阻斷HMGB1對ALDO誘導NRK-52E細胞自噬的影響

3 討論

慢性腎臟病是當代全球危害人類健康的重大疾病，其發病機制十分復雜。近年來研究發現，ALDO是CKD進展的一個關鍵遞質，可獨立于腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）直接參與腎小管損傷和腎間質纖維化的過程［4］。ALDO促發的炎癥反應與線粒體功能障礙所致的細胞內ROS產生過量有關，但其確切機制尚未闡明［5-7］。在骨骼肌缺血/再灌注損傷研究中發現，ALDO可誘導HMGB1分泌增加，激活TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，致使遠隔心肌組織損傷［8］。Abdulmahdi等［9］在膿毒癥致人腎近端小管（HK-2）細胞損傷模型中發現氧化應激參與了HMGB1的釋放。對于HMGB1在ALDO誘導腎小管上皮細胞自噬中的作用尚鮮見報道。本研究發現，10 nmol/L ALDO處理NRK-52E細胞24 h后，細胞內ROS的水平較Control組明顯升高；ALDO+HMGB1抗體組細胞內ROS的水平較ALDO組明顯降低，上述結果提示HMGB1參與了ALDO促發的炎癥反應過程。

HMGB1是一種高度保守的核蛋白，可以通過主動分泌和被動釋放兩種方式進入胞外，除了在免疫和炎性過程中發揮作用外，還可作為調節因子影響細胞自噬［10］。胞漿內的HMGB1與自噬相關蛋白Beclin-1結合，激活自噬。自噬發生時，胞漿中的LC3-Ⅰ發生斷裂，與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-Ⅱ并定位在自噬小體膜上；而泛素結合蛋白p62則可直接偶聯在LC3上，參與自噬體的構成［11］。有研究報道，HMGB1可誘導心肌細胞自噬相關蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達上調，而抑制HMGB1后上述蛋白表達明顯降低［12］。而本研究中，10 nmol/L ALDO刺激NRK-52E細胞后，HMGB1和IL-1β蛋白的表達均較Control組增加，同時細胞自噬也增加（Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達上調，p62的表達下調）。經50μmol/L NAC預處理NRK-52E細胞后，IL-1β蛋白的表達較ALDO組明顯下調；而給予1 mg/L HMGB1抗體預處理后，LC3-Ⅱ蛋白的表達較ALDO組明顯降低、p62蛋白的表達較ALDO組明顯增加。上述研究結果表明，HMGB1可能是通過刺激IL-1β的釋放，加重氧化應激和炎癥反應，進而誘導腎小管上皮細胞自噬，以維持細胞的穩態和完整性。

綜上所述，ALDO可能通過促進腎小管上皮細胞內ROS的產生，增加HMGB1分泌，刺激炎癥因子IL-1β的釋放，進而誘導自噬的發生；抑制HMGB1的釋放可逆轉這一現象。HMGB1可能作為ALDO誘導腎小管上皮細胞損傷的新靶點，在慢性腎臟病的治療中發揮重要作用，后期將深入研究其具體的分子機制。