消結安對大鼠子宮肌瘤超微結構影響的實驗研究

葉娟，郝迪，王梓，李旭，孫國珍，賈淑杰△

子宮肌瘤是一種常見且發病率極高的婦科疾病，發病率在育齡期女性中高達20%～50%，且呈逐年上升趨勢［1-2］。50歲以上女性有80%～90%被發現患有子宮肌瘤［3］。子宮肌瘤會引起疼痛、月經過多或不孕。子宮肌瘤的發展隨年齡增長而增加?，F階段，臨床多采用手術和藥物進行治療，但手術治療可對患者子宮造成影響，且術后并發癥多。我院認為對于子宮肌瘤，可先使用中藥治療來縮小肌瘤體積，降低手術難度、減少手術出血、增加微創手術機會，使機體損傷較小，縮短康復時間。消結安是我院應用50余年的臨床治療子宮肌瘤的經驗方，臨床取得了較好的療效。該藥是以扶正祛瘀立法治療子宮肌瘤藥方，具有軟堅散結、通經活絡、化瘀止血、清熱解毒等功效。目前國內對子宮肌瘤超微結構研究的報道較少。本研究旨在運用雌、孕激素制備子宮肌瘤大鼠模型基礎上，通過對子宮肌瘤細胞超微結構變化來觀察消結安對子宮肌瘤的防治作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 消結安浸膏，由黃芪、白術、山楂、三棱、莪術、雞內金、醋五靈脂、地龍、透骨草、地錦草和知母組成，規格：4 g生藥/mL浸膏；桂枝茯苓膠囊，江蘇康緣藥業股份有限公司，規格：0.31 g/粒，生產批號：18020608341；苯甲酸雌二醇注射液，哈爾濱三馬獸藥業有限公司，規格2 mL∶4 mg，批號20170401。黃體酮注射液，天津金耀藥業有限公司，規格10 g/L，生產批號：1703271。

1.2 實驗動物 雌性SD大鼠48只，SPF級，體質量200 g左右，8周齡，健康無異常，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0003。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備 參考文獻［4］方法，選用雌、孕激素雙膜法制備模型，苯甲酸雌二醇每周3次肌內注射，每只0.06 mL，連續10周，之后增加黃體酮注射液每周2次肌內注射，每只0.1 mL，連續5周，整個造模周期為15周。

1.3.2 分組及給藥 模型制備成功大鼠按體質量隨機分為5組，模型組，消結安高、中、低劑量組，陽性藥組，另設正常組，每組8只。造模結束后經口給予消結安，每天1次，連續4周，給藥劑量為20 mL/kg。消結安劑量選用臨床用量的16倍、8倍、1倍，分別為64 g生藥/kg，32 g生藥/kg，4 g生藥/kg，陽性藥：桂枝茯苓膠囊，0.31 g/kg。

1.3.3 指標測定 末次給藥后第2天，所有動物稱取體質量，腹主動脈取血，化學發光法測定血清雌二醇、孕酮含量；肉眼觀察各組大鼠子宮組織形態和色澤的改變，游標卡尺量取子宮頸以上橫徑，左側分角子宮根部起的子宮直徑。電子天平稱量子宮、卵巢質量，計算子宮、卵巢系數。子宮系數（mg/g）=子宮質量/大鼠體質量；卵巢系數（mg/g）=卵巢質量/大鼠體質量。甲醛固定部分子宮組織待做HE染色，進一步進行病理觀察；一部分子宮組織在戊二醛固定液中迅速將其剪成2 mm×2 mm的小塊，將組織移入裝有戊二醛溶液的小瓶內固定，固定結束后再經2%PBS液沖洗，包埋切片，透射電鏡下觀察子宮組織超微細胞結構的改變。

1.4 統計學方法 使用SPSS 17.0統計軟件包進行統計分析。計量資料數據以表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠子宮大體解剖發現 正常組大鼠子宮呈肉紅色，血管豐富，有光澤，宮體纖細，卵巢大小正常；而模型組大鼠子宮顏色發白，無光澤，宮頸體短粗，直徑增大明顯，分角根部腫脹異常，子宮腔內充滿分泌液，子宮體顯著增大，卵巢萎縮變小，見圖1。

Fig.1 Gross anatomy of rat uterus in model and control group圖1 模型組與正常組大鼠子宮大體解剖對照

2.2 消結安對子宮肌瘤大鼠子宮形態的影響 模型組子宮系數、分角直徑和分角根部直徑均大于正常組，卵巢系數小于正常組（P＜0.05）。陽性藥組、消結安各劑量組子宮系數、分角直徑和分角根部直徑均小于模型組（P＜0.05）。消結安各劑量組子宮系數、分角直徑和分角根部直徑與陽性藥組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。模型組、陽性藥組、消結安各劑量組卵巢系數均小于正常組（P＜0.05），但陽性藥組、消結安各劑量組卵巢系數與模型組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 消結安對各組大鼠血清雌激素、孕激素的影響 正常組血清雌二醇及血清孕酮含量均小于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。消結安各劑量組血清雌二醇和孕酮均低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；消結安各劑量組與陽性藥組比較，差異無統計學意義，見表2。

Tab.1 Effects of Xiaojie-An on uterine morphology inrats with uterine fibroids表1 消結安對子宮肌瘤大鼠子宮形態的影響（n=8，x±s）

Tab.2 Effects of Xiaojie-An on serum levels of estrogen and progesterone in six groups of rats表2 消結安對6組大鼠血清雌激素、孕激素的影響（ng/L，x±s）

2.4 各組大鼠子宮組織超微細胞結構的觀察 正常組：正常肌細胞，胞質內細胞器正常，細胞周圍膠原纖維排列規則。模型組：細胞核近似呈橢圓形，核體積增大，見少數畸形核的核面略有凹痕，異染色質邊聚于核膜下；胞質內線粒體輕度腫脹，部分嵴斷裂消失；可見部分粗面內質網輕度擴張，輕度的顆粒融合和脫顆?，F象，細胞內含有較豐富的肌微絲，并見脂褐素。陽性藥組與消結安各劑量組結構相似，細胞器豐富，肌微絲豐富，線粒體部分嵴融合模糊不清，粗面內質網可見輕度的顆粒融合和脫顆?，F象，見圖2。

Fig.2 Comparison of ultrastructures of rat uterus between six groups圖2 6組大鼠子宮組織超微細胞結構比較

2.5 消結安對大鼠子宮一般組織形態學影響 對照組子宮內膜呈分泌期變化，間質可見不同程度的嗜酸性白細胞浸潤，肌層未見異常。模型組子宮內膜呈分泌期變化，子宮平滑肌層增厚，肌細胞數量增多肥大，排列欠規整，少量中性粒細胞浸潤。高、中、低劑量組和陽性藥組與模型組比較均有一定改善，子宮平滑肌層變薄，結構尚清楚，肌細胞基本恢復常態；但肌層見局部增厚，肌細胞數量增多肥大，排列欠規整。以高劑量組和陽性藥組為佳，見圖3。

3 討論

中醫學認為瘀血內阻是肌瘤發病的病機關鍵，或氣滯血瘀，或痰濕瘀結，或氣虛血瘀［5-6］。臨床多從虛、從瘀而治子宮肌瘤。目前臨床尚鮮見對子宮肌瘤的發病機制作出明確闡述，認為子宮肌瘤最初的形成機制可能與女性激素、免疫、遺傳等因素有關，但具體的發病機制仍不明確［7-8］。

消結安是以扶正祛瘀立法治療子宮肌瘤藥方，軟堅散結，通經活絡，化瘀止血，清熱解毒；用于子宮內膜異位癥及子宮肌瘤，方中黃芪、白術、山楂益氣健脾，三棱、莪術、雞內金、醋五靈脂破血行氣，消積止痛，消癥散結；地龍、透骨草、地錦草清熱解毒；知母涼潤，既可濟黃芪之熱，又可滋腎水之枯。全方體現了扶正祛邪兼顧，消癥瘕而不傷正，益氣血而不礙癥瘕消除的宗旨。

本實驗在成功制備大鼠實驗性子宮肌瘤模型的基礎上，觀察消結安對病變大鼠各項子宮大體指標影響。實驗結果表明，消結安能降低子宮肌瘤大鼠的子宮質量、子宮系數、卵巢系數、分角直徑和分角根部直徑。消結安各劑量組與陽性藥組間比較，差異無統計學意義。

Fig.3 Typical HE staining images of rat uterine tissues in six groups(×200)圖3 6組大鼠子宮典型HE染色圖像（×200）

許多研究表明，雌激素是子宮肌瘤發生機制中的重要促長激素，雌激素可促進有絲分裂，從而影響卵巢激素的正常分泌，引起女性生殖功能障礙，最終導致子宮肌瘤的發生，并可刺激子宮肌瘤增長。而孕激素可進一步促進和維持子宮肌瘤細胞上的雌激素受體含量。卵巢是分泌雌二醇和孕酮最主要的器官，動物模型制備中發現，長期外源性高水平卵巢激素的刺激導致大鼠卵巢萎縮，卵巢系數下降［9］。本實驗通過對各組大鼠血清性激素水平的檢測，發現子宮肌瘤具有明顯的雌孕激素依賴性，實驗表明，正常組血清雌二醇和孕酮水平均低于模型組，證明了在肌瘤的發生、發展上雌激素、孕激素均有重要作用。與模型組比較，消結安能降低血清中雌二醇和孕酮的含量，表明消結安對子宮肌瘤有一定的預防及治療作用，各劑量組與陽性藥組比較，差異無統計學意義。病理組織學研究顯示，消結安高、中、低劑量組和陽性藥組均有一定改善，子宮平滑肌層變薄，結構尚清楚，肌細胞基本恢復常態，以高劑量組和陽性藥組為佳；透射電鏡下觀察消結安能有效改善子宮肌瘤大鼠子宮細胞超微結構病變，改善子宮平滑肌細胞的局灶性增生和部分膠原纖維的紊亂，抑制平滑肌細胞的異常增殖。

綜上，本實驗結果表明消結安確有降低子宮系數，降低血清性激素，改善子宮肌瘤大鼠子宮細胞超微結構病變的作用，其作用機制有待于進一步實驗研究。