CD22 CAR-T挽救治療CD19 CAR-T治療后短期復發的TP53突變陽性難治急性B淋巴細胞白血病一例

穆娟，呂海容，李靜怡，江嫣雨，張蕊，孟娟霞，袁婷，鄧琦

成人急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是最常見的成人急性白血病之一，占成人急性白血病的20%～30%［1］。攜帶TP53基因突變的B細胞ALL患者緩解率低、易復發、生存差，異基因造血干細胞移植是其公認的有望得到治愈的治療手段［2-3］。采用抗CD19嵌合抗原受體修飾（chimeric antigen receptor，CAR）的T細胞治療復發/難治性（relapsed or refractory，R/R）B細胞ALL可達70%～90%的應答率［4-5］。CD22在B淋巴細胞中也有表達，對于CD19 CAR-T治療失敗的患者，可采用CD22 CAR-T細胞治療。我院收治1例攜帶TP53基因突變的難治性Ph-ALL患者，經自體CD19 CAR-T細胞治療緩解后14 d復發，其外周血CD19 CAR-T細胞消失的同時檢測到CD19 CAR的DNA拷貝數異常增高；后予以自體CD22 CAR-T細胞治療達到完全緩解（complete response，CR），橋接單倍體異基因造血干細胞移植治療，病情穩定，現報告如下。

1 病例報告

1.1 病例資料 患者 女，31歲。主因乏力、皮膚出血點伴低熱10 d，于2018年6月7日入本院。患者10 d前無誘因出現乏力、皮膚出血點，伴有發熱，體溫最高37.4℃，就診于當地醫院，查血常規：白細胞計數3.4×109/L，血紅蛋白132 g/L，血小板計數33×109/L。骨髓穿刺：急性淋巴細胞白血病，原幼淋巴細胞93%，為進一步治療于我院就診。既往體健。入院血常規：白細胞計數8.71×109/L，血紅蛋白100 g/L，血小板計數35×109/L。骨髓細胞學：急性淋巴細胞白血病，增生活躍，原淋89%；白血病免疫分型（圖1）：93.9%細胞為惡性原始B淋巴細胞，表達CD19+CD10+CD20+CD38+CD22+，部分表達CD33+；TP53基因突變：89%；急性白血病43種融合基因陰性；染色體：正常。查體：雙側頸部、腋下腹股溝均可觸及腫大淋巴結。頸部及胸腹CT：頸部、雙側腋窩及縱隔內、腹腔、腹膜后及雙側腹股溝多發增大淋巴結。確診為攜帶TP53基因突變的Ph-急性B淋巴細胞白血病。明確診斷后給予VDCP方案誘導化療：環磷酰胺1.2 g第1天，柔紅霉素40 mg/m2第1～3天，長春地辛4 mg第1、8、15、22天，潑尼松60 mg/d第1～14天、第15～28天逐漸減量。化療結束復查骨髓細胞學：原始淋巴細胞12.5%，白血病免疫分型：13.31%為惡性原始淋巴細胞，提示為部分緩解（partial remission，PR）。再次予以原方案誘導28 d，復查骨髓細胞學：原始淋巴細胞55.5%、白血病免疫分型（圖1）：74.09%為惡性原始淋巴細胞，療效評詁為未緩解（non-remission，NR）。TP53基因突變為74.5%。

Fig.1 Flow diagram of the patient圖1 患者流式細胞圖

1.2 檢測方法 急性淋巴細胞白血病的免疫分型診斷、骨髓及外周血CD19 CAR-T、CD22 CAR-T細胞的檢測，采用流式細胞術檢測。CD19 CAR-T、CD22 CAR-T細胞DNA水平的檢測采用實時定量PCR方法。

1.3 CD19 CAR-T細胞治療 患者以難治B細胞ALL入組“CD19 CAR-T治療復發難治B細胞淋巴瘤及急性B淋巴細胞白血病（ChiCTR-ONN-16009862）”臨床試驗。單采自體外周血單個核細胞行CD3磁珠分選作為培養CD19 CAR-T細胞的T細胞來源。經FA方案預處理：氟達拉濱30 mg/m2第1～5天，阿糖胞苷1 g/m2第1～5天；分次回輸二代CD19 CART細胞：第1次回輸1×106/kg，第2次回輸1×106/kg。回輸第1天開始出現持續高熱，回輸第13天體溫恢復正常，回輸日至回輸第14天體溫（38.20±1.27）℃，伴有畏寒、寒戰、咽痛；監測生命體征和臨床癥狀穩定（表1）。C反應蛋白、細胞因子升高（表2）。于回輸第0、4、7、14、21、28天監測外周血CD19 CAR-T細胞（圖2）；并進行CAR19的DNA檢測（圖3）。于回輸第12天體溫恢復正常，評估細胞因子釋放綜合征（cytokine-release syndrome，CRS）2級［6］，予以非甾體抗炎藥對癥處理及支持治療。于回輸第14天復查骨髓涂片：增生活躍（-），未見原始幼稚淋巴細胞；白血病免疫分型：未見原始B淋巴細胞，療效評估達完全緩解，TP53基因突變38.44%。

Tab.1 The side effects of CD19 CAR-T and CD22 CAR-T cell treatment表1CD19 CAR-T和CD22 CAR-T細胞治療的不良反應觀察

Tab.2 Changes in cytokine levels in CD19 CAR-T and CD22 CAR-T cell treatment表2CD19 CAR-T和CD22 CAR-T細胞治療的細胞因子水平變化

1.4 CD19 CAR-T細胞治療緩解后的短期復發 患者達CR 2周后返院預行同胞全合異基因造血干細胞移植，復查骨髓涂片提示骨髓復發；白血病免疫分型（圖1）提示51.49%為原始B淋巴細胞，表達CD19+CD10+CD20+CD38+CD22+。患者外周血CD19 CAR-T比例為0，CD19 CAR的DNA水平為424 000.3 Copies/ng gDNA，TP53基因突變52.25%。將患者第1次CAR-T治療凍存的外周血單個核細胞復蘇，重新進行CD3磁珠分選CD3+T細胞體外培養，于體外培養第4天（CD19病毒轉染日）進行流式檢測，可見培養體系存在1.41%的CD19+CD10+ALL細胞殘留（圖4）。

Fig.2 Changes in the proportion of peripheral blood CAR-T cells圖2 兩次CAR-T細胞治療外周血CAR-T細胞比例變化

Fig.3 Changes of expression of CAR gene圖3 兩次CAR-T細胞治療外周血CAR基因表達變化

Fig.4 ALL cells remaining in the system during the preparation of CAR-T圖4 CD19 CAR-T細胞制備過程中體系殘留的ALL細胞

1.5 CD22 CAR-T細胞治療 患者CD19 CAR-T細胞治療短暫緩解后復發，以復發難治B細胞ALL病例入組“CD22 CAR-T治療復發難治B細胞淋巴瘤/急性B淋巴細胞白血病（ChiCTR1800019298）”臨床試驗。經地西他濱+FLAG［地西他濱20 mg/m2第1～5天，粒細胞集落刺激因子（G-CSF）75μg第2天-中性粒細胞恢復，氟達拉濱30 mg/m2第3～7天；阿糖胞苷1 g/m2第3～7天］預處理，回輸二代CD22 CAR-T細胞：回輸日2.61×106/kg。回輸第1天出現發熱，體溫最高38.3℃，很快下降，無其他不適（表1）。C反應蛋白、細胞因子升高（表2）。于回輸第0、4、7、14、21、28天檢測到外周血CD22 CAR-T細胞，未檢測到CD19 CAR-T細胞；并進行外周血CD19 CAR和CD22 CAR的DNA檢測（圖2、3）。評估CRS為1級。于第14天復查骨髓涂片：增生活躍-，未見原始幼稚淋巴細胞；白血病免疫分型（圖1）：未見原始B淋巴細胞，療效評估達完全緩解，TP53基因突變陰性。全身彌散磁共振：頸部及縱隔內、腹腔、腹膜后及雙側腹股溝未見增大淋巴結，雙側腋窩多發小淋巴結，考慮良性。

1.6 單倍體異基因造血干細胞移植治療 患者病情穩定，移植前外周血CD22 CAR-T細胞比例1.3%，CD19 CAR-T細胞0。外周血CD19 CAR的DNA水平22 050 Copies/ng gDNA；CD22 CAR的DNA水平3 055 Copies/ng gDNA。放棄同胞全和供者，選擇父供女單倍體異基因造血干細胞移植（含地西他濱：20 mg/m2移植前14 d至移植前10 d橋接的預處理方案），過程順利。移植后14 d復查骨髓涂片及白血病免疫分型：未見原始B淋巴細胞；供者嵌合98.53%；TP53基因突變陰性。外周血CD22 CAR-T細胞0，CD19 CAR-T細胞0。外周血CD19 CAR的DNA檢測1 940 Copies/ng gDNA；CD22 CAR的DNA檢測陰性。于移植后28 d給予供者淋巴細胞輸注（CD3+細胞1.7×107/kg），CD19 CAR的DNA水平進一步下降。患者于移植后58 d高熱、皮疹、口腔潰瘍，考慮急性移植物抗宿主病Ⅰ級，給予糖皮質激素緩解。目前移植后10個月，供者嵌合99.63%、TP53基因突變陰性，CD19 CAR和CD22 CAR的DNA水平仍保持陰性，擬繼續給予移植后維持治療，并密切觀察疾病轉歸情況。

2 討論

CAR-T治療是近20年來極具發展前景的腫瘤過繼免疫細胞治療方法［7］，其中針對難治復發急性B淋巴細胞白血病的抗CD19 CAR-T細胞表現出令人滿意的療效［8］。盡管CD19 CAR-T在急性B淋巴細胞白血病中有顯著的臨床效果，但多數患者很快復發，B淋巴細胞表面CD19表達丟失或減少是CD19 CAR-T治療失敗或緩解后復發的重要因素［9-10］，但其機制尚不明確，可能是多因素作用的結果［9，11］。

本例患者在CD19 CAR-T治療緩解后2周復發，為CD19+復發。筆者發現，其外周血CD19 CAR-T細胞消失的同時，檢測到異常高表達的CD19 CAR基因，且TP53表達再度升高。遺憾的是患者復發時未能留取骨髓標本，不能進行流式分選以檢測CD19 CAR基因是否存在于白血病細胞中。有文獻報道1例復發B-ALL患者在接受CD19 CAR-T治療緩解并進行造血干細胞移植治療后9個月復發。其復發的白血病細胞為CD19-表達，但該白血病異常表達抗CD19 CAR基因，證實CD19 CAR基因被引入了單個白血病細胞中，導致最終的CD19-復發。其機制在于CD19 CAR基因的轉入，與自體白血病細胞表面的CD19表位結合，使其CD19不表達，從而不能被CD19 CAR-T細胞所識別導致復發［12］。本例患者CD19 CAR-T治療緩解后2周復發，與其CD19 CAR-T細胞制備過程中CD3磁珠分選的CD3+T細胞存在1.41%的白血病細胞殘留有關，還是與TP53基因突變有關需進一步研究驗證。

該患者復發后馬上接受CD22 CAR-T細胞治療獲得第2次完全緩解，而且其TP53基因突變亦轉陰，繼而橋接單倍體造血干細胞移植治療。隨著供者干細胞的植入，患者體內異常高表達的CD19 CAR基因水平明顯降低，但CD19 CAR基因水平的降低，是移植物還是移植過程中糖皮質激素的作用，筆者將繼續深入研究并追蹤此病例，監測其CD19 CAR基因表達水平變化，以及是否與其移植后復發具有相關性。

本例另外一個特點是其TP53基因突變為89%，為預后不良、成為難治ALL病例的重要因素之一［13］。本例治療過程中，在CD22 CAR-T細胞治療的預處理和異基因造血干細胞移植的預處理中，均采用了地西他濱的聯合治療，以提高療效［14-15］。但TP53基因突變是否與CD19 CAR-T治療緩解后2周復發具有相關性，也需進一步探討，也是筆者繼續追蹤該患者移植后情況的一個重要觀察指標。

CD22同樣在B淋巴細胞上表達，成為難治復發急性B淋巴細胞白血病的另外一個CAR-T細胞治療靶點［16］。CD22在大多數急性B淋巴細胞白血病病例中也表達，而且通常在免疫治療后復發的患者中，白血病細胞CD19缺失后仍有CD22的表達，理論上可以作為CD19-復發的難治復發急性B淋巴細胞白血病患者的挽救治療。有報道采用CD22CAR-T細胞治療21例難治復發急性B淋巴細胞白血病，17例患者既往接受過CD19單抗免疫治療，其中15例患者接受過CD19 CAR-T細胞治療，其CD19均為陰性或者弱陽性，治療結果CR率可達73%，且安全性良好［17］。此研究進而設計了一個針對CD19和CD22的雙特異性CAR-T細胞小鼠動物實驗，對于CD19+CD22+、CD19-CD22+的急性B淋巴細胞白血病細胞均具有良好的殺瘤效果，提示在難治復發急性B淋巴細胞白血病的誘導緩解方面可能更有效。對于本例患者，復發時大量CD19+CD22+白血病細胞，同時高表達的CD19 CAR基因，筆者給予患者CD22 CAR-T細胞治療，期間CRS為1級，不良反應較CD19 CAR-T治療輕，并獲得完全緩解，直至接受異基因造血干細胞移植治療，與上述文獻報道結果相似。

總之，在CAR-T細胞的制備過程中應注意進一步提高磁珠分選CD3+細胞的純度、避免混入白血病細胞；另外一個方面CD22 CAR-T治療可以作為CD19 CAR-T治療復發的一個挽救治療措施、或與CD19 CAR-T聯合使用以提高療效。