miRNA-455-5p對人結腸癌HT-29細胞株PIK3R1基因靶向調控作用的研究

柯孔亮 王金秋 樓婷婷 張魯青 繆淳迪 郭宇

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見惡性腫瘤，在所有癌癥死亡原因中居第3位[1]。在我國，CRC發(fā)病率和死亡率均較高[2]。由于CRC的發(fā)生、發(fā)展過程復雜且影響因素較多，到目前為止其發(fā)病機制尚未完全清楚[3]。微小 RNA（microRNA，miRNA）是內源性非編碼RNA，分子量小，長度為22～25個核苷酸，在真核生物中廣泛存在[4]。研究表明，miRNA在調控細胞生長、分化以及凋亡等過程起至關重要作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，是惡性腫瘤的潛在治療靶點及預后評估指標[5-7]。miRNA-455-5p是近年發(fā)現(xiàn)的小分子RNA，位于第6條染色體。多項研究表明，miRNA-455-5p與多種實體惡性腫瘤相關，如在甲狀腺髓樣癌、黑色素瘤、胃癌等腫瘤中表達下調[8-10]。本研究團隊前期檢測了miRNA-455-5p在CRC及癌旁組織中的表達，同時研究了上下調miRNA-455-5p在3株結腸癌細胞株中的表達，利用信息數(shù)據(jù)庫預測磷脂酰肌醇三激酶調節(jié)亞單位α（PIK3R1）可能是miRNA-455-5p的靶基因[11]。本文在前期研究的基礎上，探討miRNA-455-5p對人結腸癌HT-29細胞株PIK3R1基因靶向調控作用，以進一步驗證PIK3R1基因是miRNA-455-5p的靶基因?，F(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人結腸癌HT-29細胞株（上海諾百公司）。Trizol試劑（15596-026，美國 Invitrogen公司），逆轉錄酶（R250-01，美國Invitrogen公司），熒光染料 SYBR GreenⅠ（CS7561，美國 Invitrogen公司），RNA 酶抑制劑（E00381，立陶宛 Fermentas公司），oligo dT/Random primer/特異性引物（Oligo，美國 Invitrogen 公司），Platinum Taq DNA多聚酶（10966034，美國 Invitrogen公司），100mM dNTPs（18427013，美國 Invitrogen公司），羊抗兔-辣根過氧化物酶（ab205719，上海艾博抗公司），Protein Marker（DM111-01，TransGen公司），mTOR（7C10）兔單克隆抗體（#2983，美國Cell Signaling Technology公司），抗-AKT1抗體（bs-0115R，北京博奧森生物技術有限公司），HEK293細胞（sciencellZQ0034，上海雅吉生物科技有限公司），雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega E1910，上海力敏實業(yè)有限公司），腔腸素（40904ES02，上海翊圣公司），內切酶（ER0051 BamHI，立陶宛Fermentas公司），T4 DNA連接酶（EP0061，立陶宛Fermentas公司），質粒小抽試劑盒（AP-MN-P-250，美國Ayxgen公司），質粒中抽試劑盒（AP-MD-P-25，美國Ayxgen公司），質粒大抽試劑盒（AP-MX-P-25，美國Ayxgen公司）。高速冷凍離心機（Neofuge13R，上海Heal Forcegons公司），生物安全柜（HFSafe-1800，上海 Heal Force公司），實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（qRTPCR）儀（CFX96TMReal-Time Systerm，美國BIO-RAD公司），成像系統(tǒng)（Gel Doc2000，美國 BIO-RAD 公司），垂直電泳系統(tǒng)（1658003，美國BIO-RAD公司），熒光素酶測定儀（Turner GloRunner，美國Turner BioSystems公司），脂質體 2000（11668-019，美國 Invitrogen公司），減血清培養(yǎng)基（31985，美國GIBCO公司），熒光顯微鏡（IX51，日本Olympus公司）。

1.2 方法 細胞培養(yǎng)及轉染、qRT-PCR、免疫印跡試驗等在寧波市第一醫(yī)院中心實驗室完成；雙熒光素酶報告基因實驗在寧波市杭州灣醫(yī)院實驗室完成。細胞實驗納入標準：（1）實驗用的細胞為對數(shù)增殖期細胞；（2）細胞轉染時，F(xiàn)am-NC驗證CRC細胞株HT-29的轉染效率，當轉染效率＞50%時可用于后續(xù)實驗；（3）HT-29細胞使用HieffTransTMLiposomal Transfection Reagent脂質體核酸轉染試劑轉染6孔板細胞效果最好的陽性比例為70%～80%。

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染 復蘇HT-29細胞并調整好細胞狀態(tài)。提前1d鋪板，按3×105個/ml接種到6孔板中，分成兩組，每組鋪3個孔。37℃培養(yǎng)過夜，使細胞密度達到70%～80%；第2天分別將5μl Hieff脂質體核酸轉染試劑、總量為100pmol的siRNA轉染至miRNA-455-5pinhibitor（抑制劑組）、miRNA-455-5p-mimics（模擬劑組）、miRNA-455-5p-mimics-NC（模擬劑對照組）、miRNA-455-5p-inhibitor-NC（抑制劑對照組）以及Fam-NC（陽性對照組）的細胞株中，48h后收集細胞，見圖1。HT-29細胞培養(yǎng)條件：McCOY’s 5A+10%胎牛血清+1%pen-strep（optional）；0.05%Trypsin 消化 1～2min；1∶2傳代，約2d長滿；3d左右傳代1次。

圖1 HT-29 細胞轉染結果（a：空白對照組；b：模擬劑組；c：陽性對照組；d：模擬劑對照組；e：抑制劑組；f：抑制劑對照組）

1.2.2 PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA表達的檢測 采用qRT-PCR法。將收集的細胞沉淀反轉錄到cDNA，用sybr染料法進行 PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA 表達的檢測。（1）RNA抽提：對樣本進行組織研磨、貼壁細胞洗滌、懸浮細胞去培養(yǎng)基等處理后，置于RNaseFree的1.5ml離心管中；加入1 000μl Trizol試劑，劇烈搖晃，靜置5min；加200μl氯仿，振蕩混勻，室溫靜置5min；12 000g、4℃離心15min；將上清液轉移至新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10min；12 000g、4℃離心10min；棄上清液，除盡異丙醇，加入1 000μl 75%無水乙醇，12 000g、4℃離心 5min；棄上清液，待沉淀干燥后加入DEPC處理水30～50μl；RNA電泳和OD檢測質檢。（2）引物合成：miRNA-455-5p、PIK3R1、AKT1及MTOR合成的引物序列，見表1。（3）調整RNA濃度，按照實驗目的稀釋RNA至統(tǒng)一濃度；取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管，每個樣本加入以下組分，得到MixⅠ共 20μl體系：5μg 總 RNA 5μl，rimer（50μM oligo dT） 0.5μl，andom primer 0.5μl，0mM dNTP Mix 1μl，EPC-treated water 5μl；在 MixⅠ里加入以下成分，得到MixⅡ共 20μl體系：5xFirst-Strand buffer 4μl，0.1M dTT 2μl，Naseout（40U/μl）1μl，SuperScripⅢ RT（200U/μl）1μl，MixⅠ12μl。反應條件：25℃ 5min，50℃ 60min，70℃15min。（4）將獲得的引物與cDNA模板進行擴增，反應體系：ddH2O 23μl，10×PCR Buffer 2.0μl，Mg2+（50mM）2.0μl，dNTPs（10mM）0.5μl，Primer F（10μM）0.5μl，SYBR（20×）1.0μl，Primer R（10μM）0.5μl，Taq enzyme（5U/μl）0.2μl，Template 1.0μl，總體積 20μl。每個樣本反應總量20μl，反應條件：95℃ 2min，95℃ 10s，60℃ 60s，70℃45s，共40個循環(huán)；Melt（70～95℃）。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量，ΔΔCt=待測樣品（Ct目-Ct內）-對照樣品（Ct目-Ct內）。

1.2.3 PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白表達的檢測 采用免疫印跡試驗。收集模擬劑組、模擬劑對照組、抑制劑組、抑制劑對照組轉染48h后的細胞沉淀，裂解、抽提蛋白、蛋白定量、上樣檢測。具體步驟如下：BCA法測定樣品濃度，40μg上樣；聚丙烯酰胺凝膠90V跑完積層膠后，將電壓升至200V直到電泳結束。取下凝膠，恒壓100V、恒流250mA轉膜約1.5h；取膜，PBST洗滌4次，5min/次。將膜置于5%脫脂奶粉封閉液中，37℃封閉 1h；用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中4℃過夜。次日取出膜，PBST洗膜4次，5min/次。用含5%牛奶的封閉液稀釋二抗，膜在二抗中37℃反應1h。取出膜，置于干凈的盒子中洗膜4次，5min/次。最后ECL顯影，曝光。利用Image J軟件計算灰度值，即蛋白相對表達量。

表1 miRNA-455-5p、PIK3R1、AKT1及MTOR合成的引物序列

1.2.4 miRNA-455-5p的PIK3R1靶基因驗證 采用雙熒光素酶報告基因實驗。構建PIK3R1的3′非編碼區(qū)（3′UTR）報告載體（包括野生型和突變型載體），測序驗證正確后小抽制備質粒。將miRNA-455-5p的啟動子序列與PIK3R1的3′UTR插入到熒光素酶表達序列前方，構成報告基因質粒，若此轉錄因子能激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉入因子的作用強度成正比。提前1d鋪板，293細胞按8×104個/ml接種到24孔板中，分成5組[空白對照組、陽性對照組（陽性對照質粒pds162）、wt-455-5P-mimic組（CL1011-1-PDS162_psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTRWT_-fluc）、wt-mimics-NC組（CL1011-1-PDS162_psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTR-WT_-fluc）]，每組鋪 3 個孔。37℃培養(yǎng)過夜，使細胞密度達到70%～80%。第2天分別以脂質體核酸轉染試劑 2.3μl、DNA 0.8μg+sirna 30pmol轉染細胞48h，收集上清液進行分泌型熒光素酶（Gluc）檢測，裂解細胞沉淀進行非分泌型熒光素酶（Fluc）檢測，計算Gluc/Fluc值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-455-5p 上下調后 PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA相對表達量比較 與模擬劑對照組比較，模擬劑組PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA相對表達量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與抑制劑對照組比較，抑制劑組PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA相對表達量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 miRNA-455-5p上下調后PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA相對表達量比較

2.2 miRNA-455-5p 上下調后 PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白相對表達量比較 與模擬劑對照組比較，模擬劑組PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白相對表達量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與抑制劑對照組比較，抑制劑組PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白相對表達量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖2和表3。

2.3 雙熒光素酶報告基因實驗驗證靶基因 構建PIK3R1的3′UTR報告載體（包括野生型和突變型載體）：CL1011-1-PDS162_psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTRWT_-fluc;CL1011-2-PDS162_psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTR_-MUT-fluc，結果測序驗證正確，見表4。本實驗熒光素酶切位點位于XhoⅠ/NotⅠ，見圖3。轉染293細胞48h后，陽性對照組、wt-455-5P-mimic組、wt-mimics-NC組、mut-455-5p-micmics組、mut-mimics-NC組Gluc/Fluc 值分別為 11.52±0.38、5.66±0.16、9.42±0.36、9.10±0.35、9.42±0.36，其中 wt-455-5P-mimic 組明顯低于 wt-mimics-NC 組（P＜0.05），見圖 4；說明 hsa-miRNA-455-5p能與PIK3R1基因的3′UTR結合，降低PIK3R1蛋白的翻譯水平。

圖2 miRNA-455-5p上下調后PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白表達的電泳圖

表3 miRNA-455-5p 上下調后 PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白相對表達量比較

表4 PIK3R1的3'UTR報告載體測序結果

3 討論

圖3 雙熒光素酶骨架載體信息（PDS162_psicheck3-gluc-fluc，5 882bp；熒光素酶切位點位于XhoⅠ/NotⅠ）

圖4 雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果（Y1：wt-455-5P-mimic組；Y2：wt-mimics-NC 組；Y3：mut-455-5p-micmics組；Y4：mutmimics-NC 組；*P＜0.05）

miRNA是一類內源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，在動植物中參與轉錄后基因表達上午調控[4]。miRNA參與生命過程中重要進程，包括早期發(fā)育、細胞增殖、細胞凋亡、細胞死亡、脂肪代謝以及細胞分化等[12]。目前對miRNA的研究還處于初級階段，它在高級真核生物體內對基因表達的調控作用，可能與轉錄因子一樣重要，可能代表在一個新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達調控方式[13]。但是miRNA的多數(shù)功能仍是個謎。miRNA-RISC對靶基因mRNA的作用主要取決于它與靶基因轉錄體序列互補的程度，主要有以下3種作用方式[14]：（1）切斷靶基因的mRNA分子。miRNA與靶基因完全互補結合，最后切割靶mRNA。在植物中，大部分miRNA采用這種方式進行調控。（2）抑制靶基因的翻譯。作用時與靶基因不完全互補結合，進而抑制翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性，此類miRNA是目前發(fā)現(xiàn)最多的。但在植物中極少數(shù)miRNA通過此方式來抑制靶基因。（3）結合抑制。具有以上2種作用模式，當與靶基因互補結合時，直接靶向切割mRNA；當與靶基因不完全結合時，起著調節(jié)基因表達的作用。生物信息學數(shù)據(jù)顯示，每個miRNA可以調節(jié)數(shù)百個靶基因，這表明miRNA可能影響所有的信號途徑。最近有證據(jù)表明，miRNA突變或異位表達與人類多種癌癥相關，miRNA可以起到腫瘤抑制基因或癌基因的功能，miRNA可以抑制重要的腫瘤相關基因的表達，可能在癌癥的診斷和治療中起著重要作用[15-16]。如何精確鑒定miRNA所調節(jié)的靶基因是目前所存在的挑戰(zhàn)之一。由于miRNA和其結合位點并不是完全互補的，可以存在短的錯配和G-U配對。因此，利用簡單的BLAST確定其靶基因是不可能的。但是，最近的生物信息學手段開始利用同一家族的成熟miRNA在5′末端具有高度的同源性這一特點。因此，大多數(shù)生物信息學算法利用一個包含了成熟miRNA的2～8位的3′UTR的互補序列?，F(xiàn)單個基因的3′UTR具有幾個miRNA的結合位點，這表明miRNA調控基因表達存在著復雜的組合模式。由于miRNA可能調節(jié)數(shù)個信號通路，這些miRNA的缺失或異常表達可能與疾病相關，包括腫瘤[17]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-455-5p在多種腫瘤中以抑癌基因低表達狀態(tài)的形式存在[18-20]，但關于它在CRC的研究并不多見。Yang等[21]研究表明，miRNA-455-5p是作用于靶基因galectin-9在結腸癌中發(fā)揮靶向調控作用。筆者前期對miRNA-455-5p在CRC中的表達及生物學特性進行了研究，結果表明CRC組織miRNA-455-5p相對表達量低于癌旁正常黏膜組織；在經(jīng)轉染后的CRC細胞中，上調miRNA-455-5p可抑制CRC細胞增殖和遷移，促進細胞凋亡，并通過靶基因預測軟件預測了PIK3R1是miRNA-455-5p的靶基因之一[11]。這表明miRNA-455-5p發(fā)揮抑癌基因的作用機制可能與調控PIK3R1基因的表達有關[19]。本研究則關于miRNA-455-5p對人結腸癌HT-29細胞株PIK3R1基因靶向調控的作用進行了研究，采用雙熒光素酶報告基因實驗驗證miRNA-455-5p的靶基因。PI3K分為3類，其結構和功能各異。其中研究最廣泛的是Ⅰ類PI3K，它是異源二聚體，由1個調節(jié)亞基和1個催化亞基組成，該亞基通常稱為p85，含有SH2和SH3結構域，與相應結合位點的靶蛋白相互作用。而PIK3R1則是PI3K調節(jié)亞基p85α，各種信號分子通過與p85α亞基的結合后才能激活PI3K[22-23]。AKT是一類AGC家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它是PI3K下游的主要效應分子之一，主要通過直接磷酸化多個轉錄因子而發(fā)揮作用。PI3K/AKT信號通路參與調控下游多個轉錄因子（如AKT、Mtor、XIAP等），在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[24]。

本研究檢測了miRNA-455-5p上下調后PIK3R1 mRNA和蛋白的表達情況，結果表明：抑制miRNA-455-5p后，能促進HT-29細胞PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA及蛋白表達；與模擬劑對照組比較，上調miRNA-455-5p 能抑制 HT-29 細胞 PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA及蛋白表達；這說明miRNA-455-5p上下調對PI3K/AKT信號通路具有抑制和激活作用，也說明了miRNA-455-5p是通過PIK3R1基因起調控作用的，PIK3R1可能是miRNA-455-5p的靶基因之一。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)是以熒光素為底物來檢測螢火蟲熒光素酶活性的一種報告系統(tǒng)。通過熒光測定儀測定熒光素氧化過程中釋放的生物熒光，可以靈敏、高效地檢測基因的表達，是檢測轉錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。本研究采用雙熒光素酶報告基因檢測法分析轉錄因子miRNA-455-5p與PIK3R1基因啟動子區(qū)DNA的相互作用，結果表明：hsa-miRNA-455-5p 與 psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTR-WT_-fluc共轉染293細胞48h后檢測的Gluc/Fluc值與 mimics-N與 psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTR-WT_-fluc共轉染48h后比較明顯降低，這說明hsa-miRNA-455-5p能與PIK3R1基因的3′UTR結合，降低PIK3R1蛋白的翻譯水平，即驗證了PIK3R1是miRNA-455-5p的靶基因。

綜上所述，miRNA-455-5p對人結腸癌HT-29細胞株PIK3R1基因具有負向調控作用，PIK3R1基因是miRNA-455-5p調控的靶基因。而miRNA-455-5p是如何通過靶基因PIK3R1在PI3K/AKT信號通路中影響腫瘤細胞的增殖、凋亡及轉移的機制，有待進一步研究。