鋅指蛋白545對結直腸癌上皮間質轉化和遷移侵襲的影響

潘烽平 陳一鵬 李彥 張明明

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤[1-2]。腫瘤細胞早期侵襲和轉移是結直腸癌患者的主要死亡原因[3]。因此，深入研究結直腸癌侵襲和轉移的分子機制具有重要意義。鋅指蛋白545（ZNF545）是一種轉錄因子，參與調節細胞增殖、分化和轉移等過程。近期研究表明，ZNF545在多種腫瘤發生、發展過程中具有重要作用[4-6]。本課題組前期研究結果提示，ZNF545在結直腸癌組織中的表達異常缺失，并與腫瘤發生、發展及患者的預后顯著相關[7]。然而，ZNF545在結直腸癌上皮間質轉化（EMT）和侵襲轉移中的作用及其分子機制尚不明確。因此，筆者研究了ZNF545對結直腸癌細胞EMT的調控以及遷移和侵襲能力的影響，并探索可能的分子機制，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 人結直腸癌細胞株及培養 人結直腸癌細胞株SW480、Caco2、Lovo和HCT116購自上海中國科學院研究所。使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，在37℃、5%CO2條件下培養。

1.2 質粒構建和細胞轉染 先采用免疫印跡試驗檢測 4 株結直腸癌細胞 SW480、Lovo、Caco2、HCT116 中ZNF545表達水平。選取內源性ZNF545高表達的細胞用于敲低實驗，低表達的細胞用于過表達實驗。由上海吉凱公司設計并合成特異性沉默ZNF545的siRNA（siRNA-ZNF545）及陰性對照siRNA（siRNA-control），采用Lipofectamin 2000（Invitrogen公司）將siRNA轉染內源性ZNF545高表達的SW480細胞。過表達ZNF545的質粒（pcDNA3.1-ZNF545）及對照質粒（pcDNA3.1-control）購自上海吉凱公司，采用Lipofectamin 2000將質粒轉染內源性ZNF545低表達的HCT116細胞。

1.3 ZNF545對結直腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響 采用Transwell小室實驗。將各組細胞分別饑餓12h，經消化、離心重懸，以1×105個/ml的細胞密度重懸于200μl無血清培養基中，均勻鋪于Transwell小室的上室，并在下室加入400μl含10%胎牛血清的培養基；培養48h后，甲醇固定Transwell小室的下層細胞，結晶紫染色、清水沖洗，最后用棉簽輕輕拭去上層細胞，在顯微鏡下觀察、拍照。細胞侵襲實驗除采用基質膠（Matrigel膠）包被的Transwell小室外，其余步驟同遷移實驗。

1.4 EMT相關分子標志物蛋白表達檢測 采用免疫印跡試驗。取對數生長期的細胞，加入適量含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的細胞裂解液（RIPA）提取細胞總蛋白，離心取上清液。采用蛋白濃度測定（BCA）法檢測蛋白濃度，加入樣本緩沖液后煮沸變性。取50μg蛋白樣品進行上樣，采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉至聚偏氟乙烯膜，再用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，分別加入ZNF545（1∶1 000，英國 Abcam 公司）、E 鈣黏蛋白（E-cadherin）（1∶1 000，英國 Abcam 公司）、磷酸化鋅指轉錄因子（slug，1∶1 000，英國 Abcam 公司）和磷酸甘油醛脫氫酶（1∶100，英國 Abcam 公司）抗體，于 4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后加入過氧化物酶標記的抗兔或抗鼠二抗（1∶1 000，英國 Abcam 公司），室溫孵育 2h。TBST 緩沖液洗膜后，使用化學發光試劑發光顯影。

1.5 ZNF545表達變化對結直腸癌細胞E-cadherin表達的影響 采用細胞免疫熒光檢測。細胞成功爬片后，甲醛固定（室溫，30min）；滴加ZNF545一抗液，將玻片平置于濕盒內，4℃過夜；加入異硫氰酸熒光素-兔抗鼠免疫球蛋白G抗體，室溫孵育2h；再用熒光染料（DAPI）復染，沖洗后封片，在熒光顯微鏡高倍鏡下觀察拍照。

1.6 統計學處理 采用SPSS 25.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZNF545在結直腸癌細胞系中的表達 內源性ZNF545蛋白在SW480細胞中表達最高，在Lovo、Caco2細胞中的表達次之，在HCT116細胞中表達最低，見圖1。故本研究挑選了內源性ZNF545高表達的SW480細胞用于敲低實驗，低表達的HCT116細胞用于過表達實驗。

圖1 SW480、Lovo、Caco2、HCT116中 ZNF545 蛋白表達電泳圖

2.2 ZNF545對結直腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響 過表達ZNF545后，HCT116細胞遷移和侵襲能力明顯減弱，穿過小室基底膜的平均細胞數明顯減少（P＜0.01），見圖2a（插頁）；敲低ZNF545表達后SW480細胞遷移和侵襲能力明顯增強，穿過小室基底膜的平均細胞數明顯增多（P＜0.01），見圖 2b（插頁）。

圖2 ZNF545對結直腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響（a：過表達ZNF545抑制腸癌細胞的遷移和侵襲能力；b：敲低ZNF545表達后增強腸癌細胞的遷移和侵襲能力）

2.3 ZNF545對EMT相關分子標志物的影響 過表達ZNF545明顯增加腫瘤侵襲轉移相關的關鍵抑癌基因E-cadherin的表達，同時抑制E-cadherin的轉錄抑制因子slug的表達，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖3a。敲低ZNF545表達后抑制E-cadherin的表達，同時增加slug的表達，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖3b。

圖3 ZNF545對EMT相關分子標志物的影響（a：過表達ZNF545抑制腸癌細胞中slug的表達，增加E-cadherin的表達；b：敲低ZNF545表達后增加腸癌細胞中slug的表達，抑制E-cadherin的表達）

2.4 ZNF545表達變化對結直腸癌細胞E-cadherin表達的影響 與空白對照組（HCT116組）及陰性對照組（NC組）比較，HCT116過表達ZNF545組（ZNF545組）E-cadherin的表達明顯增加，見圖4a（插頁）。與空白對照組（SW480組）及陰性對照組（si-NC組）比較，SW480敲低ZNF545組（si-ZNF545組）E-cadherin的表達明顯減少，見圖4b（插頁）。

圖4 ZNF545表達變化對結直腸癌細胞E-cadherin表達的影響（a：過表達ZNF545增加E-caherin表達；b：敲低ZNF545表達后抑制E-caherin表達；細胞免疫熒光檢測）

3 討論

惡性腫瘤的EMT行為是近年來確定的、與腫瘤增殖、侵襲、轉移密切相關的生物學過程[8]。通過EMT，上皮細胞可轉化為具有抗凋亡、降解細胞外基質、極性丟失、促侵襲轉移等特性的間充質表型細胞[9-10]。近年來，關于EMT與腸癌細胞侵襲和轉移的關系研究增多，相關研究發現腸癌中普遍存在上皮標志物E-cadherin的表達丟失以及間充質標志物波形蛋白Vimentin、β-鏈蛋白（β-catenin）、N-cadherin和E-cadherin的轉錄抑制因子slug、ZEB1/ZEB2表達升高[11-12]。由于基因突變、表達丟失等原因導致的關鍵抑癌基因功能缺失而引起上述EMT關鍵分子的表達改變，在驅動腸癌的侵襲、轉移過程中發揮著重要作用。

ZNF545是新發現的KRAB型鋅指轉錄因子。有研究提示，ZNF545在人正常組織中廣泛表達；但在肝癌[13-14]、胃癌[4]、乳腺癌[15]及結直腸癌[16]組織中由于其啟動子區CpG島的異常甲基化，導致ZNF545表達缺失。但目前尚無關于ZNF545在結直腸癌EMT和侵襲轉移中作用的相關報道。本研究首先檢測了ZNF545在各結直腸癌細胞系中的表達，然后挑選了內源性ZNF545高表達的SW480細胞用于敲低實驗；內源性ZNF545低表達的HCT116細胞用于過表達實驗。通過Transwll小室實驗檢測ZNF545對結直腸癌細胞的影響，發現沉默ZNF545可以顯著增強細胞的遷移和侵襲能力，而過表達ZNF545則顯著降低細胞的遷移和侵襲能力。免疫印跡試驗檢測發現，沉默ZNF545可增加間質標志物slug蛋白的表達，同時抑制上皮標志物E-cadherin的表達；過表達ZNF545則抑制slug的表達，同時增加E-cadherin的表達。細胞免疫熒光實驗進一步證實，ZNF545能夠調控E-cadherin的表達。上述實驗結果證明，結直腸癌組織中ZNF545的缺失表達，可能通過誘導結直腸癌EMT從而促進結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力。在結直腸癌組織中，ZNF545啟動子的異常甲基化導致ZNF545低表達，進而激活結直腸癌細胞EMT轉化，增強腫瘤細胞的轉移能力。因此，ZNF545在結直腸癌的發生、發展過程中扮演了重要的角色。

綜上所述，ZNF545在結直腸癌的進展過程中發揮抑癌基因的作用，通過抑制EMT而降低結直腸癌細胞遷移和侵襲能力，靶向調控ZNF545表達可能為結直腸癌的防治提供新的方向。