產前發熱對新生兒宮內細菌感染及臍血 miRNA-155、NF-κB信號通路指標的影響

張麗亞 陳黎麗 羅芳

宮內感染是指孕婦在圍生期受病原體感染后致胎兒感染，是引起早產及一系列早產合并癥的重要原因[1]。在新生兒感染中，越來越強調母體產前發熱的影響；《新生兒敗血癥診斷及治療專家共識（2019年版）》也強調了母體產前發熱的地位[2]。miRNA-155誘導的核因子-κB（NF-κB）信號通路激活促使趨化因子和細胞因子過表達，在炎癥發病機制中發揮著關鍵作用[3]。本研究就產前發熱對新生兒宮內細菌感染的影響及及臍血miRNA-155、NF-κB信號通路指標的影響作一探討，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年1至12月在寧波市婦女兒童醫院分娩的、產前體溫＞37.5℃、無胎膜早破、經嚴格消毒后分娩的單胎孕婦及其新生兒200例為產前發熱組，同期無產前發熱但其余條件相同的100例單胎孕婦及其新生兒為健康對照組。產前發熱組與健康對照組在年齡、孕次、產次、分娩孕周方面比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 1。排除標準：（1）最近 2 周使用過抗菌藥物；（2）合并嚴重的心、肝、腎等臟器功能障礙性疾病；（3）合并糖尿病及妊娠高血壓疾病。

1.2 方法

1.2.1 絨毛膜炎的診斷 在分娩時，距胎膜破口5cm出取大小約2cm×2cm的胎膜組織，常規甲醛固定石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察。組織學絨毛膜羊膜炎表現為絨毛膜及羊膜組織中有炎性細胞浸潤。

1.2.2 新生兒宮內細菌感染的診斷 依據臨床癥狀及血培養進行確定。判斷標準：血培養陽性，臨床表現為皮膚發灰、呼吸暫停、呼吸＞60次/min、呼吸功能不全、血壓降低、嗜睡、心動過緩或過速、肌張力減低。

1.2.3 新生兒臍血炎癥指標的檢測 （1）樣本采集：胎兒娩出后、斷臍前采集臍血標本5ml，4℃、3 000r/min離心10min，收集血清，-80℃低溫保存。（2）逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測臍血 miRNA-155、p65、p50、NF-κB 復合物抑制因子 α（IκBα）、IKB 激酶 β（IKKβ）、白細胞介素8（IL-8）的基因表達量：取200μl復溶的血清于離心管中，加入1ml Trizol試劑充分混勻裂解；分別用氯仿、異丙醇及DEPC水配制的70%乙醇處理；取DEPC-H2O溶解RNA，-80℃低溫保存。使用紫外分光光度計、1%瓊脂糖凝膠電泳分別測定RNA濃度和完整性。按照逆轉錄試劑盒說明將RNA逆轉錄為cDNA并進行PCR擴增。miRNA-155（上游引物：GCCTTAATGCTAATCGTGATAG，下游引物：TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT），p65（上游引物：GCGAGAGGAGCACAGATACC，下游引物：CTGATAGCCTGCTCCAGGTC），p50（上游引物：CCTGGATGACTCTTGGGAAA，下游引物：TCAGCCAGCTGTTTCATGTC），IκBα（上游引物：GCAAAATCCTGACCTGGTGT，下游引物：GCTCGTCCTCTGTGAACTCC），IKKβ（上游引物：GCTGCAACTGATGCTGATGT，下游引物：TGTCACAGGGTAGGTGTGGA），IL-8（上游引物：CACCGGAAGGAACCATCTCA，下游引物：AAACTTCTCCACAACCCTCTGC），β-actin（上游引物：CGTGGACATCCGCAAAGAC，下游引物：CATCTGCTGGAAGGTGGACAG）。反應條件：94℃變性 2min；94℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 30s，40個循環。使用Smart View凝膠數字成像系統掃描分析擴增產物條帶，分別測定各擴增帶灰度值，以各目的基因擴增帶灰度值比內參照β-actin擴增帶灰度值作為基因相對表達量。（3）酶聯免疫吸附測定檢測臍血IL-8。超敏C反應蛋白（hs-CRP）水平，具體操作按試劑說明書進行。

表1 產前發熱組與健康對照組產孕婦一般資料比較[例（%）]

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 產前發熱組與健康對照組絨毛膜炎及新生兒宮內細菌感染發生率比較 產前發熱組孕婦絨毛膜炎發生率為68.0%（136/200），明顯高于健康對照組的15.0%（15/100），差異有統計學意義（P＜0.05）；新生兒宮內細菌感染發生率為50.0%（100/200），明顯高于健康對照組的10.0%（10/100），差異亦有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 產前發熱組與健康對照組新生兒臍血炎癥指標比較 產前發熱組 miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IL-8 基因表達量及IL-8。hs-CRP水平均明顯高于健康對照組，IκBα基因表達量低于健康對照組，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見表 2。

2.3 產前發熱程度與絨毛膜炎、新生兒宮內細菌感染發生率及新生兒臍血炎癥指標的關系 以產前1周體溫38.5℃為界，將產前發熱的200例孕婦分為高熱組92例、低熱組108例。高熱組孕婦絨毛膜炎、新生兒宮內細菌感染發生率，miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IL-8基因表達量及IL-8。hs-CRP水平均明顯高于低熱組，IκBα基因表達量低于低熱組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 3。

2.4 產前發熱時間與絨毛膜炎、新生兒宮內細菌感染發生率及新生兒臍血炎癥指標的關系 以產前發熱持續時間24h為界，將產前發熱的200例孕婦分為長時間組80例、短時間組120例。長時間組孕婦絨毛膜炎、新生兒宮內細菌感染發生率，miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IL-8基因表達量及IL-8。hs-CRP水平均明顯高于短時間組（均P＜0.05），IκBα基因表達量低于短時間組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表4。

2.5 產前發熱時間與發熱程度的關系 產前發熱長、短時間組孕婦發熱程度比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表 5。

3 討論

絨毛膜炎的最主要臨床表現是母親發熱[4]，是新生兒敗血癥的危險因素之一。本研究結果顯示產前發熱孕婦絨毛膜炎發生率為68.0%，新生兒宮內細菌感染發生率為50.0%；進一步分析顯示，發熱程度越高，發熱持續時間越長，新生兒宮內細菌感染發生率明顯升高，分析原因可能是早產兒免疫系統發育不完善所致，隨著母親發熱時間的延長，母嬰感染的風險明顯增高，臨床醫生應提高警惕。

研究表明，miRNA可調節TLR2/4-NF-κB信號通路[5-6]。miR-155是糖皮質激素發揮抑炎作用的新調控分子，糖皮質激素可通過抑制NF-κB下調miR-155表達，上調細胞因子信號轉導抑制蛋白1表達，從而促進JAK激酶/信號轉導和轉錄激活因子信號轉導途徑的激活，最終達到抗炎目的[7]。因此，深入研究NF-κB信號通路在產前發熱造成宮內感染的激活情況、抑制細胞因子和趨化因子過表達引起的氣道炎癥，對于新生兒宮內感染的治療具有重要作用。在靜止細胞中，NF-κB與其抑制蛋白IκB結合，在細胞質中形成無活性的NF-κBIκB復合體。當細胞受到氧化。應激等因素的刺激后，IKKs活化，IκB在IKKs復合物的作用下發生磷酸化而降解，NF-κB與IκB解離并進入細胞核，進而調控細胞因子、趨化因子等基因的轉錄。本研究結果顯示，產前發熱孕婦分娩新生兒臍血 miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IL-8基因表達量及IL-8、hs-CRP水平均明顯高于健康對照組，IκBα基因表達量明顯低于健康對照組；產前發熱孕婦絨毛膜炎及新生兒宮內細菌發生率明顯高于健康對照組。這證實產前發熱可導致miRNA-155-NF-κB信號通路的激活，同時絨毛膜炎與宮內細菌感染存在直接聯系。進一步作亞組分析，結果顯示產前發熱程度及持續時間與新生兒宮內細菌感染的發生有關。但是本研究產前發熱組孕婦絨毛膜炎及新生兒宮內細菌感染發生率高于其他文獻報道[8-9]，可能與個體差異、入選偏倚因素等有關，故本研究結果僅作為該類疾病發病率的參考。

表2 產前發熱組與健康對照組新生兒臍血炎癥指標比較

表3 產前高、低熱組孕婦絨毛膜炎、新生兒宮內細菌感染發生率及新生兒臍血炎癥指標比較

表4 產前發熱長、短時間組孕婦絨毛膜炎、新生兒宮內細菌感染發生率及新生兒臍血炎癥指標比較

表5 產前發熱長、短時間組孕婦發熱程度比較[例（%）]

綜上所述，產前發熱孕婦絨毛膜炎及新生兒宮內細菌感染發生率較高，臍血miRNA-155基因表達上調，NF-κB信號通路激活；產前1周體溫＞38.5℃或持續時間＞24h者表現更明顯。對于產前發熱孕婦，檢測新生兒臍血 miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IκBα、IL-8 基因表達及IL-8、hs-CRP水平等，有利于預測新生兒宮內細菌感染、盡早診斷與治療。