甘草次酸對kk-Ay糖尿病小鼠早中期腎纖維化的保護作用

劉文靜　南一　魯玉梅　袁玲

摘要：目的?探討甘草次酸（glycyrrhetic?acid）對kk-Ay糖尿病小鼠早中期腎纖維化的保護作用，從而揭示甘草次酸通過調節腎纖維化相關蛋白的表達，延緩早中期糖尿病腎纖維化進展。方法?利用自發性KK-Ay糖尿病模型小鼠，建立預期糖尿病（Diabetes?Mellitus，DM）早中期腎纖維化模型（即將6周齡KK-Ay小鼠用KK專用高脂飼料飼喂6周）。再分別給予高、低濃度的甘草次酸連續灌胃干預10周。1.觀察測量腎纖維化小鼠的體重、血糖變化;2.采用全自動生化分析儀檢測總膽固醇（TG），甘油三酯（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）;3.利用光鏡及透射電鏡觀察（TEM）腎臟組織形態、病理變化;4.采用免疫組織化學法檢測Lamininl（層黏連蛋白）、E-cadherin（鈣黏蛋白）、α-SMA（α-平滑肌動蛋白）腎間質纖維化指標及腎纖維化轉化因子TGF-β1的表達情況。結果?與C57空白對照組小鼠比較，模型組小鼠的體重、空腹血糖明顯增加（P<0.05）;血生化檢測顯示模型組小鼠Scr、BUN、TC、TG，LDL顯著增加，HDL減小（P<0.05），而經過甘草次酸藥物組干預后體重、血糖，以及Scr、BUN、TC、TG、LDL明顯減輕，而HDL增加（P<0.05）。通過HE染色、Masson三色法，透射電鏡顯示：甘草次酸對kk-Ay糖尿病腎病小鼠早中期腎小球、腎小管及間質均有明顯的修復及保護作用;免疫組化結果顯示：經過甘草次酸處理后，層黏連蛋白-1、α-SMA、TGF-β1的表達降低，E-鈣黏蛋白增加了（P<0.05）。結論?甘草次酸對kk-Ay糖尿病模型小鼠早中期腎纖維化具有保護作用，可能通過影響腎纖維化轉化因子TGF-β1、Lamininl、E-cadherin、α-SMA纖維化相關蛋白的表達，從而延緩早中期糖尿病腎間質纖維化的進展。

關鍵詞：甘草次酸;?KK-Ay小鼠;?EMT;?Lamininl;?E-cadherin;?α-SMA

中圖分類號：R285?文獻標志碼：A?文章編號：1007-2349（2020）03-0072-07

隨著人們生活習慣和飲食結構的改變，糖尿病（Diabetes?Mellitus，DM）人數所占全球總人數比例明顯呈上升趨勢，繼而糖尿病腎病（Diabetic?Kidney?Disease，DKD）的數目也在不斷地增加[1-2]。糖尿病腎病是糖尿病嚴重的微血管并發癥之一，也是導致糖尿病患者死亡的主要原因之一，在國內也是終末期腎功能衰竭的主要原因。目前，嚴格控制葡萄糖和血壓適用于臨床實踐，但治療效果并不理想。近年來眾多研究者將目光投向了傳統中醫藥寶庫，它在糖尿病腎病的治療中起到了很好的補充作用。

甘草是中醫治療中最常用的草本植物，屬于豆科植物。古代文獻記載甘草無毒且具和百藥解百毒作用，在中藥處方中最為常用。現代研究表明甘草中主要的活性物質-18β-甘草次酸（GA），是甘草中的主要有效成分，是由甘草根莖中提取的五環三藉類化合物。18β-GA是具有多種藥理功能的藥物，具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗潰瘍、抗氧化、降血脂、鎮咳、改善胰島素抵抗以及免疫調節等多種藥理作用。近年來GA在腎臟相關疾病的治療研究方面也有了很大的進展，包括對于腎臟缺血再灌注以及腎臟慢性鎘中毒的保護作用。但是相關報道還是很少，因此本實驗著重探討GA對于DN動物模型的治療效果，以期待為DN的治療提供新的參考依據[3-5]。

1?材料與方法

1.1?實驗材料?動物：選用KK/upj-Ay/J小鼠（6周齡）SPF級，雄性75只和C57BL/6J（6周齡）SPF級，雄性對照小鼠15只，體重25±2?g，購買于北京維通利華有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0004，于寧夏醫科大學動物實驗中心屏障內適應性飼養1周，并觀察有無不良反應。飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司提供：普通飼料（總熱能14KJ/g：蛋白質20%、脂肪8%、碳水化合物5%）;高脂飼料purina#5008（粗蛋白23.5%、粗脂肪6.5%），許可證號：SCXK（京）2014-0008。

1.2?藥物制備?選用甘草次酸（glycyrrhetic?acid）—18β-GA，使用前用蒸餾水配成濃度為0.36?g/mL、0.72?g/mL藥物濃縮液，放置冰箱備用。

1.3?實驗試劑?血糖試紙（德國羅氏公司，批號：06454038），磷酸鹽緩沖液（Phosphate?Buffered?Saline，PBS）（北京索萊寶科技有限公司），水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，國藥準字號H37022673）無水乙醇（天津市化學試劑廠，批號：20060406），4%多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20080203）Anti-Laminin抗體（公司，批號）、Anti-E-cadherin抗體、、Anti-α-SMA抗體、Anti-TGF-β1抗體。

1.4?實驗方法

1.4.1?造模與分組?將6齡雄性KK-Ay小鼠30只給予KK飼料，飼養至12周齡，根據隨機血糖≥13.9mmol/L測定糖尿病模型。模型建立后，隨機分為4組：KK-Ay中早期糖尿病腎病模型組10只、甘草次酸組（低劑量GL：0.36?g·kg-1·d-1;高劑量GH：0.72?g·kg-1·d-1）各10只，另10只C57BL/6對照小鼠，給予普通飼料飼養。連續給藥10周至小鼠達到22周齡。

1.4.2?小鼠體重、血糖?在固定時間每周測量小鼠的體重，然后記錄求平均值。通過血糖試紙尾靜脈采血法以2周的間隔測量小鼠的空腹血糖并記錄。

1.4.3?血生化檢測?在給藥10周后處死所有小鼠。從腹主動脈收集血液并以3000?g/min離心15分鐘。分離血清用于檢測總膽固醇（TC），甘油三酯（TG），尿素氮（BUN），低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）通過自動生化分析儀檢測上述生化指標（BS-120，Mindary，Shenzheng）。

1.4.4?組織病理學（HE染色、Masson三色法、透射電鏡）檢測?KK-Ay小鼠給藥10周后處死，并取材腎臟，將其左腎沿腎門部位縱剖為2片，二分之一腎臟放于4%多聚甲醛溶液中進行前固定，腎組織乙醇梯度脫水、透明，進口石蠟包埋，切成5μm的薄片粘附載玻片上，進行H&E、Masson染色、免疫組化，在光鏡下觀察腎組織病理學變化。另一片切成0.2?cm×0.1?cm大小塊狀，置于特殊固定液中固定供電鏡用，經常規脫水、透明、樹脂包埋處理后，用透射電鏡觀察腎組織微小結構變化。

1.4.5?免疫組化分析?經過脫水，脫蠟和修復抗原對腎組織切片進行封閉，然后與一抗稀釋液一起孵育TGF-β1（1：100），E-鈣黏蛋白（1：100）和α-SMA（1：50），層黏連蛋白-1（1：100），4°C孵育過夜然后加入二抗。然后用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌切片并加入顯色劑。最后蘇木精染色以定位細胞核。

1.5?統計學方法?所有數據均表示為平均值±標準偏差。使用SPSS?23.0通過單因素方差分析進行統計分析。當方差齊時，使用最小顯著差異（LSD）測試。當方差不齊時，使用Tamhane的T2檢驗。P<0.05被認為具有統計學意義。

2?結果

2.1?KK-Ay小鼠體重、血糖變化結果?在高脂高糖KK飼料誘發飼喂12周的時間，觀察發現KK-Ay小鼠飲食量、尿量明顯增加，毛發干枯易脫落，說明出現明顯地DM癥狀。與C57空白組比較，模型組小鼠組體重顯著增加，且差異具有統計學意義（P<0.05），與模型組組比較，KK-Ay+GH?0.72?g·kg-1組及KK-Ay+GL?0.36?g·kg-1組體重相對下降。（P<0.05），尤以KK-Ay+GH?0.72?g·kg-1組效果顯著，說明：甘草次酸能改善KK-Ay小鼠的身體肥胖。見表1、圖1。

與空白組小鼠空腹血糖相比較，KK-Ay模型組小鼠血糖升高明顯，且差異具有統計學意義（P<0.05）;與KK-Ay組空腹血糖比較，KK-Ay+GH?0.72?g·kg-1組差異具有統計學意義（P<0.05），15周齡時，KK-Ay+GH?0.72?g·kg-1組，KK-Ay+GL?0.36?g·kg-1組有顯著性差異，說明GH?0.72?g·kg-1組和GL?0.36?g·kg-1組能夠顯著改善血糖，見表2，圖2。

2.2?血生化檢測結果?C57對照組相比，模型組TG，TC和LDL脂質代謝水平顯著升高（P<0.05）。HDL顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，給藥組TG和TC水平均有顯著變化（P<0.05）。然而，給藥組的HDL和LDL變化并不明顯，見表3。與對照組相比，模型組小鼠腎功指標Scr和BUN水平顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，治療組水平顯著下降（P<0.05）。但甘草次酸組之間的差異不顯著（表4）。因此，甘草次酸可以有效改善腎功能和脂質代謝。

2.3?組織病理學（HE染色、Masson三色法、透射電鏡）結果

2.3.1?HE染色?C57組大鼠腎臟組織結構未見明顯改變，22周齡KK-Ay組腎組織可見腎小球體積增大，系膜基質增多，基底膜增厚，腎小管出現空泡樣病變。空白組較KK-Ay模型組腎組織增生程度較輕。KK-Ay+GH?0.72?g·kg組、KK-Ay+GL?0.36?g·kg組腎組織改變較模型組組輕，見圖3。

2.3.2?Masson三色法?與C57比較，KK-Ay組可見腎小球囊體積增大，腎小球囊壁增寬，基底膜不同程度增厚，膠原纖維染色明顯，腎小管空泡樣病變，腎間質膠原纖維顯著增大。甘草次酸組與模型組比較，腎小球基底膜增厚程度沒有KK-Ay模型組組嚴重，膠原纖維染色也不甚明顯，腎間質膠原纖維沉積量少。給藥組較模型組腎臟病理情況輕。KK-Ay+GH?0.72?g·kg-1組與KK-Ay+GL?0.36?g·kg組進行比較，無顯著性差異。見圖4。

3.3?透射電鏡?空白組內可見毛細血管腔開放良好，內皮細胞，足細胞無異常，足突像梳子一樣清晰可見，毛細血管基底膜均勻，系膜區無增生。與空白組相比，模型組腎小球基底膜上足細胞足突呈矮柱狀融合、脫落，微絨毛化，基底膜變薄，系膜細胞染色質聚集，局部系膜區輕度增生，膜細胞個數大于3個;與模型組相比，甘草次酸組腎小球基底膜上足細胞足突輕度融合，基底膜輕度增厚，但厚度均勻，線粒體有損傷，基底膜上有致密物沉積，足細胞染色質邊集，見圖5。

3.4?免疫組化法檢測Laminin-1、E-cadherin、α-SMA、TGF-β1蛋白結果?與C57組相比，α-SMA、Laminin-1、TGF-β1在模型組小鼠腎小球的表達量明顯增加;與模型組比較，α-SMA、Laminin-1、TGF-β1在KK-Ay+GH?0.72?g·kg-1組、KK-Ay+GL?0.36?g·kg組表達減少;但二者無明顯差異。與C57組相比，E-cadherin蛋白在模型組KK-Ay小鼠腎小球的表達量是明顯減少;與模型組比較，E-cadherin在KK-Ay+GH?0.72?g·kg-1組、KK-Ay+GL?0.36?g·kg-1組中的表達均增加，見圖6～圖9。

4?討論

糖尿病發展為糖尿病腎病，并且將近一半的患者最終進展為終末期腎臟病[6]。慢性腎病（CKD）終末期腎衰竭的主要病理變化是腎間質纖維化，腎小球纖維化，腎血管纖維化和腎小管纖維化等。超過1/3的間質成纖維細胞源自腎小管上皮細胞的上皮質轉化（EMT），EMT的發生是一個復雜的過程，即多種病理因素可導致腎小管上皮細胞受損。損傷的腎小管細胞或炎性細胞釋放TGF-β1，誘導上皮細胞EMT變化，使上皮細胞發生獲得分泌FN的間充質細胞的表型，細胞外基質（ECM）成分引起腎間質纖維化[7]。所以抑制腎小管上皮細胞分化的EMT過程是延緩DN進展的重要目標。

有專家認為EMT能夠被劃分成四個階段：上皮細胞失去黏附能力（E-cad丟失）-重建細胞骨架蛋白肌動蛋白（a-SMA表達增多）-腎小管基底膜崩解（Laminin-1缺乏）-細胞遷移和侵襲能力增強。Laminin-1是層黏連蛋白，是細胞外基質的高分子量（400約900kDa）蛋白質。它們是基底層的主要成分，也是大多數細胞和器官的蛋白質網絡基礎，影響細胞分化遷移和黏附。研究表明層黏連蛋白-1上的非硫酸化HNK-1表位通常被嵌入并掩蓋在堅固的基底膜中，從而與其他蛋白質緊密結合[8-11]。EMT過程還涉及到很多鈣黏蛋白表達的改變，作為鈣黏附蛋白家族中重要成員之一的E-cadherin具有特殊生物學活性，它不僅是一種腫瘤細胞侵襲轉移抑制劑，也是主要的正常細胞生長接觸抑制劑。鈣黏蛋白是一類Ca2+依賴的糖蛋白，是最為經典的上皮細胞標志物。E-cad的丟失是上皮細胞轉分化的標志，會進一步促進EMT的進展，E-cad與EMT過程互相影響，最終導致上皮細胞徹底轉分化成纖維細胞造成腎小管間質纖維化[12-14]。a-平滑肌蛋白（a-SMA）屬于6種肌動蛋白家族之一。a-SMA顯著表達于發育成熟個體的血管平滑化細胞和肌性上皮細胞。a-SMA早期表達是EMT的標志物，肌成纖維細胞在腎纖維化過程中的作用主要表現在結締組織損傷修復過程中，特異性表達a-SMA，具有極強的的收縮，增殖和分泌ECM的能力。是研究上皮細胞EMT及纖維化又一標志物[15-17]。因此，抑制腎小管EMT可以減少成纖維細胞的數量，抑制ECM（細胞外基質）的合成和分泌，為預防和治療DN腎間質纖維化提供了新的途徑。

筆者對18β-甘草次酸及其衍生物在糖尿病腎病纖維化可能的作用位點及信號轉導通路進行實驗探究，發現GA在腎臟相關疾病的治療研究方面也有了很大的進展，包括對于腎臟缺血再灌注以及腎臟慢性鎘中毒的保護作用[18，19]。如李開龍等[20]認為甘草酸可通過下調腎臟中結締組織生長因子（TGF-β1）的表達抑制腎間質纖維化的發生，馬立彬等[21]通過實驗證實甘草酸二胺通過抑制TGF-β1的表達而發揮抗大鼠腎間質纖維化作用。于力[22]也證實甘草酸可以抑制細胞因子TGF-β1和基質金屬蛋白酶抑制劑的表達從而改善腎小球硬化。趙海燕等[23]研究發現：18β-甘草次酸能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂，改善胰島素抵抗。王會玲等[24]通過大鼠實驗對比甘草酸和潑尼松對慢性馬兜鈴酸腎病大鼠腎臟組織病理及超微病理改變的影響，發現甘草酸和潑尼松一樣具有改善馬兜鈴酸腎病引起的腎臟組織病理及超微結構改變且其引起體重、血壓升高的副作用低于后者。Yoke?Yin等[25]研究發現：給予大鼠甘草次酸100μg/g，24h后胰島素的敏感性有所提高，降低了血糖、三酰甘油、總膽固醇。本次實驗研究結果：模型組KK-Ay小鼠體重、空腹血糖明顯增加，說明小鼠出現了明顯的DN癥狀，通過HE染色、Masson染色、電鏡等方法檢測發現KK-Ay小鼠腎組織出現了纖維化的病理變化，經過甘草次酸長時間灌胃腎纖維化小鼠，取腎臟行HE染色觀察，結果與模型組相比腎小球大小基本正常、基底膜增生明顯減輕;系膜區纖維化改善，腎小管萎縮改善。說明較長時間內甘草次酸對模型小鼠腎功能及腎臟病理形態變化有影響。免疫組化顯示：糖尿病小鼠腎組織中TGF-β1、a-SMA、Laminin-1蛋白呈高表達，E-cad減少，說明腎組織出現明顯的纖維化。本實驗研究結果與上述文獻表述表述一致。

綜上所述，長時間甘草次酸灌胃將會影響糖尿病腎病KK-Ay小鼠腎組織E-cad及a-SMA、Laminin-1蛋白的分布及含量的變化，有助于延緩DN所致的EMT腎間質纖維化的過程。由于本次實驗主要是對甘草次酸的藥效學進行研究，但是甘草次酸對于DN動物模型的治療機制研究方面存在欠缺。下一步筆者將更深入的研究DN發病機制研究，以期待為DN的治療提供新的參考依據。

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（收稿日期：2019-10-29）