自擬蠲痹補腎方含藥血清對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖與凋亡的研究

解駿 李少華 凌蕓

摘要：目的 探討不同濃度自擬蠲痹補腎方對類風濕關節滑膜炎癥的影響機制，為臨床應用提供實驗依據。方法 Wistar大鼠32只隨機分為4組：空白對照組（滅菌用水灌胃）、自擬蠲痹補腎方高濃度組、自擬蠲痹補腎方低濃度組，雷公藤多苷片組。通過研究高低二個不同劑量的自擬蠲痹補腎方對類風濕關節炎的患者滑膜成纖維細胞的影響，探討其可能的作用機制。結果 與空白對照血清相比，自擬蠲痹補腎方含藥血清均能顯著抑制滑膜成纖維細胞PCNA mRNA、Bcl-2 mRNA表達（P<0.0001）。結論 自擬蠲痹補腎方可能是通過調節滑膜成纖維細胞PCNA mRNA、Bcl-2 mRNA表達，抑制滑膜成纖維細胞增殖而發揮作用。

關鍵詞：類風濕關節炎;滑膜炎癥;成纖維細胞

中圖分類號：R593.22 ? 文獻標志碼：A ? 文章編號：1007-2349（2020）02-0068-04

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA），在世界范圍內的發病率在1～3%左右，以慢性起病，最終累及全身多個系統的自身免疫性的病患，在我國，大約有四五百萬人受RA 的困擾，報道的致殘率可高達50%[1-2]。RA在起病的最初2-3年內會發生不可逆的關節周圍的骨丟失，進而致關節毀損和全身性骨質疏松癥的發生。RA的臨床表現為慢性、進行性及對稱性四肢多關節的炎癥，隨著疾病的發展，會引起全身多個系統的損傷。RA關節內的病理特征表現是慢性增生性炎癥和血管翳的形成，并破壞軟骨面、軟骨下骨的骨質，以及關節周圍的軟組織等，因此會造成關節內結構的毀損，最終的臨床轉歸是關節功能喪失、外觀畸形以及關節局部和全身性骨量的丟失。目前公認RA的這些病理變化均與滑膜成纖維細胞的凋亡不足密切相關，而細胞凋亡不足是大多數的腫瘤和自身免疫系統疾病的一個重要病因[3]，因此，如果加速滑膜成纖維細胞的凋亡可以有效治療RA[4]。本次實驗選用我院自擬蠲痹補腎方作為研究對象，此方具有活血散瘀、消腫止痛、補腎強骨的功效，在本院臨床使用多年，得到了廣大醫生和患者的認可。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與滑膜組織 SPF級的雌性Wistar大鼠32只，體重為（200±10）g，購自中國科學院上海實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK（滬）2007 0005，動物使用許可證號為SYXK（滬）2008 0050。所有的患者的滑膜組織均來自上海中醫藥大學附屬光華醫院關節外科。所有的病例均為女性患者，年齡（53.27±6.11）歲，病程（8±13.85）a，診斷均符合1987年美國風濕病學會診斷標準。

1.1.2 主要藥物 自擬蠲痹補腎方（方劑主要為骨碎補、白芍、仙靈脾、豨薟草、補骨脂、青風藤、黃芪、絡石藤）。雷公藤多苷片，規格：10mg/粒，購自黃石飛云制藥有限公司，生產批號：20110301。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備 32只大鼠隨機分為對照（滅菌用水）組、自擬蠲痹補腎方高濃度組、自擬蠲痹補腎方低濃度組，雷公藤多苷片組。滅菌用水組：滅菌用水3mL/只/天，分2次灌胃。自擬蠲痹補腎方組：主要以美國FDA提出的臨床等效劑量換算公式，以人的使用劑量為標準，得出大鼠的劑量，每只大鼠每天3mL，分兩次灌胃;雷公藤多苷片組3mL灌胃。連續用藥3天后，在第3天給藥后1 小時采血。選擇滅菌非抗凝劑的試管中，注射入所采的大鼠血液，室溫等待血液凝結。將所首先在37℃水溫浴1 小時，離心15分鐘（轉速：3000 轉/分鐘）分離血清，-20℃冰箱凍存備用。在使用前，先用56℃恒溫箱內30分鐘滅活，然后使用不帶血清的培養基稀釋，過濾后清除細菌。

1.2.2 原代滑膜細胞的分離培養與傳代 無菌條件下把滑膜組織置于盛有5%FBS DMEM 的15mL離心管中，并于2小時內置入盛有DMEM培養液的無菌培養皿，清除滑膜組織表面的脂肪組織及血凝塊，清洗3次。將滑膜組織剪碎至1 mm3的小塊置于6 cm2培養皿中，加入4mL DMEM培養液，再加500 μL的Ⅰ型膠原酶（終濃度為3 mg/mL），再次放入37℃ 5%CO2 培養箱內消化4小時后，見絮狀樣的關節滑膜組織。用100目的濾網過濾，加PBS沖洗，濾液離心5分鐘（1500轉/分），去除上清液。打散細胞，加入15% FBS DMEM，置10 cm2培養皿中，37℃ 5%CO2 培養箱，待細胞密集度大于80%后，消化傳代培養，當傳至第三代后，予以胰酶消化待用。

1.2.3 含藥血清對體外滑膜成纖維細胞增殖作用的影響 將濃度為2×103個/mL的第3代成骨細胞，以100 μL/孔種于96孔培養板，用2%胎牛血清培養液饑餓培養24 h后，分為4組：（1）20%空白血清組;（2）20%自擬蠲痹補腎方高濃度含藥血清組;（3）20%自擬蠲痹補腎方低濃度含藥血清組;（4）20%雷公藤多苷片含藥血清組。每組8孔，置于37℃ 5%CO2培養箱中，培養24 h，棄100μl培養液后，每孔加入20μl的噻唑基四唑（MTT）溶液（5 mg/mL），37℃孵育4 h;棄上清，每孔加150μl二甲基亞砜（DMSO）溶解結晶，置酶聯免疫檢測儀上測定吸光值（波長490nm）。計算方法：細胞存活率%=（OD試驗孔/OD對照孔）×100%。

1.2.4 含藥血清對體外滑膜成纖維細胞的PCNA mRNA、Bcl-2 mRNA表達的影響 （1）取第3代成骨細胞，予以0.25%胰蛋白酶消化后，反復吹吸成為單細胞懸液;細胞濃度調整為2×104個/mL，接種于12孔細胞培養板中，每孔1 mL，37℃ 5%CO2培養箱內培養24 h;吸凈孔板里的培養液，更換為l%胎牛血清培養液饑餓12 h;吸凈孔板里的培養液，再次更換為20%空白對照血清、20%自擬蠲痹補腎方高濃度含藥血清、20%自擬蠲痹補腎方低濃度含藥血清、20%雷公藤多苷片含藥血清組，每組3孔，再次予以培養24 h;（2）按Trizol法試劑說明書提取滑膜成纖維細胞RNA，取1μg總RNA為模板，逆轉錄成cDNA;（3）引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1;（4）實時定量PCR：將熒光染料SYBR Green和目的基因Bcl-2以及內參Actin的引物按5μl SYBR Green+0.15μl引物混勻，封膜后，放入實時PCR儀（ABI 7900）進行PCR反應，測定出PCNA mRNA表達;Bcl-2基因表達的CT值，根據公式2-△CT計算基因的相對表達量。

1.2.5 統計學處理 采用SPSS（24.0版本）軟件對實驗數據進行統計學分析，數據符合正態分布要求，按照均數±標準差表示，如果各治療組方差齊，采用LSD-t檢驗進行組間的兩兩比較;單獨2組樣本均數比較時，若方差齊，采用t檢驗，如果方差不齊，改用t′檢驗，P<0.05時有統計學意義。

2 結 果

2.1 自擬蠲痹補腎方的含藥血清對于滑膜成纖維細胞的作用 如表2所示，與空白對照組比較，當作用時間在48小時，5%、10%的自擬蠲痹補腎方含藥血清對滑膜成纖維細胞增殖均無差別;且不同濃度自擬蠲痹補腎方含藥血清對滑膜成纖維細胞增殖也未見差別;20%含藥血清作用時，高濃度的自擬蠲痹補腎方含藥血清可顯著抑制滑膜成纖維細胞增殖（P<0.001）。而表3所示，當對比空白對照組，在20%含藥血清作用時，高、低濃度自擬蠲痹補腎方及雷公藤多苷片含藥血清均能顯著抑制滑膜成纖維細胞增殖（P<0.0001），但三組之間比較均無統計學意義。

2.2 含藥血清對體外培養滑膜成纖維細胞 PCNA mRNA表達的影響 如表4所示，對比空白對照組，使用20%含藥血清干預時，高、低濃度自擬蠲痹補腎方及雷公藤多苷片含藥血清均顯示對于抑制滑膜成纖維細胞PCNA mRNA表達有顯著意義（P<0.0001），但高濃度的自擬蠲痹補腎方比低濃度更具有顯著意義（P=0.037<0.05）。

2.3 含藥血清對體外培養滑膜成纖維細胞 Bcl-2 mRNA表達的影響 與如表5所示，與空白對照血清相比，高、低濃度自擬蠲痹補腎方及雷公藤多苷片含藥血清均顯示對于抑制滑膜成纖維細胞Bcl-2 mRNA表達有顯著意義（P<0.0001），三組間均沒有統計學意義。

3 結論

自擬蠲痹補腎方可能通過調節PCNA與Bcl-2基因的表達，從而抑制滑膜成纖維細胞增殖，達到抑制炎癥與減少骨丟失的目的。

4 討論

文獻報道，在類風濕關節炎病變的關節內可見滑膜明顯增生，而這些滑膜對關節內炎癥及關節破壞過程中起著重要意義[5-7]。原因在于滑膜成纖維細胞可能會分泌各種細胞因子等產物，如蛋白酶類、花生四烯酸代謝產物等等，最終這些炎癥因子引起了RA的臨床病理變化。因此，滑膜成纖維細胞的過度增殖導致的滑膜增生是RA重要的病理特征之一[8-9]。

目前認為滑膜細胞凋亡不足，炎性滑膜細胞數目成倍數的增生，是RA的重要變化。一般正常情況下，人體可以通過增加細胞凋亡，從而清除這些過多的細胞而保持動態平衡。但加入滑膜細胞凋亡不足，就會可導致滑膜組織增生并進而出現關節破壞的一系列病理改變，因此RA發病的主要機制就是滑膜成纖維細胞增生過多和凋亡不足。因此目前認為治療RA的重要途徑之一，就是抑制滑膜成纖維細胞增殖、誘導增加其凋亡[10-11]。而傳統的植物提取物中，雷公藤紅素[12]、姜黃素等[13]據報道可以誘導DNA損傷、細胞周期阻滯以及凋亡作用，因此其可以抑制滑膜成纖維細胞增殖，是治療RA重要藥物;但由于具有高毒性以及效果不明確的缺點限制了其使用。而中藥有效成分治療RA具有多靶點、多種途徑的特點，藥理活性比較廣泛，被認為有重要的研究價值;而化學合成藥及激酶抑制劑類等藥物已經通過相關的臨床研究明確了在治療RA中的治療效果和相對可靠的安全性，但是其長期用藥的安全性仍有待觀察[14]。

類風濕關節炎（RA）屬于中醫“痹癥”“歷節”范疇。古代醫家一般認為風寒濕邪外侵是重要的外因。臨床上RA的發病多為內外因相互共同作用的結果。隨著當代醫學的持續進步，運用現代醫學的研究結果，闡明了類風濕關節炎的可能發病機理。現代醫家經過繼承發展，認為RA的性質為本虛標實，肝腎脾虛為本，濕滯、瘀阻為標。本方扶正逐邪，標本兼顧、活血散瘀、消腫止痛，正切中RA本虛標實，肝腎脾虛為本，濕滯、瘀阻為標的病機，是治療痹癥的較好的方劑。

本次實驗主要分析了本院通用的自擬蠲痹補腎方的含藥血清對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖的影響。此次我們的實驗表明：高、低濃度的自擬蠲痹補腎方含藥血清均能顯著抑制滑膜成纖維細胞PCNA mRNA表達，且高濃度的自擬蠲痹補腎方比低濃度更顯著。

目前比較公認的具有調控細胞凋亡的基因家族之一就是Bcl-2基因家族及其相關蛋白Bcl-2，而目前研究表明它與細胞凋亡可能有關的基因之一。Bcl-2是重要的細胞凋亡調節基因，其通過抑制多種形式的細胞死亡，從而延長了細胞壽命，增加了細胞數目，并且增加遺傳物質的突變率。高、低濃度的自擬蠲痹補腎方含藥血清均能顯著抑制滑膜成纖維細胞Bcl-2 mRNA表達。

本次采用中藥血清藥理學研究方法，通過觀察自擬蠲痹補腎方含藥血清對體外培養滑膜成纖維細胞增殖及凋亡的影響，我們研究結果顯示20%自擬蠲痹補腎方含藥血清的對于滑膜成纖維細胞，具有抑制增殖及促進凋亡的作用，而且實驗結表明高濃度的自擬蠲痹補腎方比低濃度的效果更明確。經定量PCR檢驗進一步證實：自擬蠲痹補腎方的含藥血清使PCNA與Bcl-2表達顯著下降，表明它能顯著抑制滑膜成纖維細胞增殖，顯示了與MTT實驗的結果的一致性，這可能是自擬蠲痹補腎方含藥血清能夠下調滑膜成纖維細胞增殖可能的作用機制之一。該研究在細胞水平及分子水平上為自擬蠲痹補腎方用于臨床RA治療提供了有力的實驗依據，在開發治療RA的新型中藥復方中，可考慮多種藥物聯合應用，從細胞分子水平、基因角度以及治療靶點入手，找出抗RA的高效治療藥物。

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（收稿日期：2019-10-18）