NR2B/CREB在人參皂苷Rb1調節甲基苯丙胺誘導大鼠條件位置偏愛中的作用

楊根夢，何翠華，洪仕君， 李 娟，黃 儉，沈寶玉，李媛媛，劉 柳，曾曉鋒，李利華

(昆明醫科大學 1. 法醫學院、2. 基礎醫學院，云南 昆明 650500)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)是一種苯丙胺類中樞神經興奮劑，外觀呈白色透明不規則晶體，又稱為“冰毒”，其具有依賴性強、復吸率高、神經毒性大等特點[1]。最新中國毒品的形勢報告顯示，近年來，新型合成毒品濫用呈蔓延之勢，METH已成為我國毒品濫用人數最多的毒品。METH成癮一方面嚴重危害毒品濫用者的身心健康，同時也對社會的安定造成嚴重影響。關于毒品成癮的神經生物學假說較多，目前被普遍認可的是獎賞物替代學說，并以此來解釋藥物濫用產生的機制[2]。但迄今為止，METH濫用成癮機制尚不清楚，并且還缺乏公認有效地治療藥物和治療手段。

NMDAR是一種谷氨酸離子型的受體，由NR1和NR2A-D亞基組成。在神經元分化、記憶形成和學習過程中具有重要作用[3]。NR2B是NMDAR發揮生理作用的重要亞基，具有增強學習和記憶能力的作用，并參與藥物依賴發生發展過程。CREB (cAMP反應元件結合蛋白) 是機體中一種重要的調節因子，磷酸化的CREB對基因的轉錄和蛋白的合成具有較為重要的調節作用，并可參與NR2B 表達的調節。此外，CREB在學習記憶中也扮演著重要作用，對海馬認知功能具有較為重要的調節作用。

條件位置偏愛(conditioned place preference，CPP)是一種衡量藥物濫用誘導獎賞效應的模型，能夠評價藥物濫用的精神依賴性，也是尋找治療藥物濫用成癮的有效工具。

人參皂苷Rb1 (ginsenoside Rb1,Rb1) 主要分布在人參、三七、西洋參等植物中，其在中樞神經系統、心血管系統、免疫系統和抗腫瘤等方面均發揮著較為重要的藥理作用。并且Rb1作為一種保護神經系統和心血管系統的抗氧化劑和抗炎劑，近年來受到越來越多的關注。研究表明，人參皂苷Rb1對HIV-TAT蛋白和METH協同誘導大鼠血腦屏障損傷具有明顯的保護作用[4]。 然而Rb1對METH成癮方面的研究較少。因此，本研究旨在研究人參皂苷Rb1對METH誘導大鼠CPP的作用并觀察NR2B和CREB是否參上述調節作用。

1 材料與方法

1.1 動物SD大鼠，♂，體質量(180～220) g，購買于昆明醫科大學實驗動物中心[SCXK(滇)K2015-0002]。動物飼養條件為12 h白天/黑夜循環，溫度控制在(23±1) ℃，大鼠可以自由飲用食物和水，所有大鼠在CPP裝置中適應環境3 d，然后進行實驗。

1.2 試劑和藥品METH來源于中國食品藥品檢定研究院(#171212-200603)，METH溶于生理鹽水，終濃度為為2 mg·kg-1。Rb1(純度89%)購自成都曼斯特生物科技有限公司(#41753-43-9)，Rb1溶于生理鹽水溶液中，終濃度為以10 mg·kg-1。抗NR2B，抗CREB和抗p-CREB體購買于CST (Danvers，MA，USA)，抗β-actin和抗兔以及抗鼠二抗購買于Sigma-Aldrich (St.Louis，MO，USA)。

1.3 CPP裝置CPP設備(上海欣軟信息有限公司，型號XR-XT401)由兩個相等大小的黑白箱組成，一側是白箱，柵欄狀黑色底面；另一側是黑色，網格狀黑色底面，黑白箱之間有一個黑色的小箱分隔，可讓大鼠自由穿梭于黑白箱之間。

1.4 CPP實驗方案本實驗動物隨機分成4個組，對照組：10 mg·kg-1生理鹽水 (i.p),METH組：2 mg·kg-1METH (i.p),Rb1組：10 mg·kg-1Rb1 (i.p),Rb1+METH組：給予METH前1 h注射Rb1。CPP實驗試驗階段 (1～3 d),每只大鼠在黑白箱之間自由活動30 min。在d 3，記錄大鼠CPP 15 min。CPP實驗階段(4-13 d),封閉黑白箱，d 4、6、8、10和12，注射生理鹽水或Rb1 1 h之后，再進行METH腹腔注射，隨后放在伴藥箱30 min；d 5、7、9、11和13，注射生理鹽水或Rb1 1 h后，腹腔注射生理鹽水并放入非伴藥箱30 min。第14 d，對大鼠進行CPP測試15 min。CPP分數統計分析方法參照文獻[5]。

1.5 Western blot分析用生理鹽水進行心臟灌注，目的是便于固定和方便分離腦組織，取出大鼠全腦組織后立即置于冰上，分離出海馬組織并保存于-80 ℃備用。用含有1% PMSF和蛋白酶及磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液裂解適量的海馬組織，并用BCA試劑盒測蛋白濃度。用12% SDS-PAGE分離等量的蛋白質(25 μg)并轉移至0.45 μm PVDF膜。膜用5%脫脂牛奶或者5% BSA在室溫下封閉2 h，隨后加入相應的一抗 (1 ∶1 000) 于4 ℃冰箱過夜。d 2加相應的二抗 (1 ∶5 000) 并于室溫下孵育1 h，最后用ECL顯影并于Bio-Rad凝膠成像儀上觀察結果。值得注意的是p-CREB蛋白很容易失活，因此分離完腦組織后應立即保存在-80 ℃，并及時提蛋白，提蛋白必須在冰上進行且裂解液應加入蛋白酶及磷酸酶抑制劑，蛋白變性后及時進行Western blot檢測。用β-actin作為內參，應用ImageJ軟件對Western blot條帶進行灰度值比較。

2 結果

2.1 Rb1對METH誘導大鼠CPP的作用METH顯著增加了大鼠在伴藥箱的時間。而提前注射10 mg·kg-1Rb1后；與生理鹽水組相比，Rb1對大鼠CPP并沒有影響，而與METH組相比，大鼠在伴藥箱的時間明顯減少，說明Rb1對METH誘導大鼠CPP具有一定抑制作用。

Fig 1 Effect of Rb1 on METH-induced CPP in n=10)Post-pre value were expressed as the place preference date[9]. The results show that Rb1 attenuates the development of METH-induced CPP. **P<0.01 vs control;#P<0.05 vs METH

2.2 Rb1對METH誘導大鼠CPP軌跡圖的作用大鼠在 CPP 箱的運動軌跡圖如Fig 2所示，注射Rb1和METH前，各組在非伴藥箱(黑箱)的軌跡比伴藥箱(白箱)多；給Rb1和METH后，給藥前后自身配對比較，METH組在伴藥箱的軌跡明顯增加；而提前注射Rb1后，與METH組相比，大鼠在伴藥箱的軌跡有所減少。

2.3 Rb1對NR2B 表達的影響METH組中NR2B的表達水平顯著升高，而提前1 h用Rb1預處理后，與METH組相比，NR2B的表達水平有所降低(Fig 3)。

2.4 Rb1對CREB，p-CREB和p-CREB/CREB表達的影響如Fig 4所示，METH顯著增加了海馬組織中p-CREB的表達水平和p-CREB/CREB的比值，而提前加入Rb1治療后，與METH組相比，p-CREB的表達水平和p-CREB/CREB的比值均有所下降，而給予METH和Rb1后，CREB表達水平均無顯著差異。

Fig 2 Effect of Rb1 on METH-induced trajectories in ratsA- D-1 represents pre-treated: control group (A-1), Rb1 group (B-1), METH group (C-1) and Rb1+METH group (D-1); A-D-2 represents post-treated: control group (A-2), Rb1 group (B-2), METH group (C-2) and Rb1+METH group (D-2).

Fig 3 Effect of Rb1 on NR2B in hippocampus of Rats were pretreated with Rb1 (10 mg·kg-1 i.p) for 1 h before METH (2 mg·kg-1 i.p), and the expression level of NR2B in hippocampus was detected by Western blot.**P<0.01 vs control;#P<0.05 vs METH.

Fig 4 Effects of Rb1 on CREB and p-CREB in hippocampus of Rats were pretreated with Rb1 (10 mg·kg-1 i.p) for 1 h before METH (2 mg·kg-1 i.p), and the expression levels of CREB and p-CREB in hippocampus were detected by Western blot.**P<0.01 vs control;#P<0.05 vs METH.

3 討論

本研究主要發現METH可明顯誘導大鼠CPP，這與之前的研究報道一致[6-7]。本研究用人參皂苷Rb1(10 mg·kg-1,i.p)進行前干預后，發現METH誘導大鼠CPP得到緩解，與METH組相比，具有統計學意義，說明10 mg·kg-1Rb1對METH誘導大鼠CPP具有抑制作用。由于CPP實驗可用來評價濫用藥物的獎賞效應，且這種行為表型的緩解可認為與藥物戒斷治療具有相同的效果[8]。因此，本研究結果認為人參皂苷Rb1可作為治療METH依賴的潛在藥物。

海馬在調節學習、記憶等方面發揮著至關重要的作用，也是腦邊緣系統中最重要的結構之一，參與學習、記憶、情緒和條件反射的形成，海馬在藥物濫用發展過程中扮演著重要作用[9-10]。因此，本研究選擇的腦區為海馬。NMDAR是重要的興奮性氨基酸離子型受體，在精神興奮劑誘導的突觸可塑性中具有重要的調節作用，研究表明，NR-2B激活后，Ca2+大量內流，胞內Ca2+濃度持續升高，可引起一系列不良反應。此外,大量Ca2+超載可誘導自由基連鎖反應，而釋放的自由基又可使細胞內Ca2+增加，如此循環，最終可致神經元發生變性和死亡[11-12]。CREB對學習和記憶過程尤為重要。本研究發現，與對照組相比，METH可誘導海馬組織中NR2B和p-CREB的表達水平明顯升高,同時p-CREB/CREB的比值升高(P<0.01)，而提前加入Rb1干預治療后，與METH組相比，NR2B和p-CREB的表達水平以及p-CREB/CREB的比值有所下降(P<0.05)。本研究與先前的研究結果一致，認為METH可誘導腦組織內NR2B表達水平明顯升高[13]。研究表明，安非他明和METH誘導大鼠CPP與大鼠海馬CA1區NR2B的表達以及紋狀體和海馬中p-CREB和p-Fos的表達有關[14]。上述研究結果均說明NR2B和p-CREB對METH成癮具有調節作用。本研究使用的Rb1具有廣泛的藥理作用，是人參的主要活性成分，對神經系統具有保護作用[15]。本研究發現，人參皂苷Rb1對METH誘導的NR2B和p-CREB表達水平升高具有抑制作用，說明人參皂苷Rb1通過調節NR2B和p-CREB對METH誘導大鼠CPP具有一定的抑制作用。此外，有研究表明，鉤藤堿可抑制METH誘導斑馬魚CPP效應，其機制與抑制NR2B的表達有關。說明NR2B在METH成癮中起著重要作用，使用藥物抑制NR2B對METH成癮具有潛在治療作用。

總之，NR2B和p-CREB參與了人參皂苷Rb1對METH誘導大鼠CPP的調節作用，但METH成癮的確切機制尚不清楚。在毒品問題全球化的影響下，尋找并開發新的治療藥物已成為解決當今毒品濫用問題的迫切需求，也是毒品濫用研究領域今后研究的重點。