沉默FGL1增強人肺腺癌PC-9細胞對多西他賽敏感性的研究

郝吉慶,程浩,高薇薇,孫翠蘭

(安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤內科, 安徽 合肥 230022)

肺癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC))占85%。NSCLC主要包括肺腺癌和鱗癌，其5年生存率大約為15%[1]。多西他賽屬于微管解聚抑制劑，是NSCLC患者的標準二線化療藥物[2]。纖維蛋白原樣蛋白1(fibrinogen-like protein 1，FGL1)是肝臟分泌的一種可促進細胞有絲分裂的特異生長因子，且在正常肝組織、腫瘤細胞和組織內呈過表達狀態[3-4]。生理條件下，FGL1主要以自分泌的形式促進細胞有絲分裂增殖[5]。目前，有關FGL1與多西他賽等藥物敏感性的研究較少。本研究旨在探討FGL1在人肺腺癌細胞株PC-9中的表達情況及其對肺癌細胞多西他賽敏感性的影響，為提高多西他賽的臨床療效提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人正常肺上皮細胞BEAS-2B及人肺腺癌PC9細胞均購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2藥物與試劑 多西他賽購于北京索萊寶有限公司(貨號ID0400)，胎牛血清購自Gibco(貨號10270106)，RPMI培養基購自Hylcone(貨號SH30022.02)，CCK-8 試劑盒購自北京索萊寶科技公司(貨號CA12110)、二喹啉甲酸(Bicinchoninicacid，BCA)試劑盒均購自Beyotime(貨號P0010S);實時熒光定量試劑盒TBGreen購自日本 TaKaRa公司(貨號RR820A),β-actin抗體購自Proteintech公司(貨號60008-1-lg)，FGL1 抗體購自Abcam公司(貨號ab197357),FGL1-siRNA重組序列、隨機陰性對照序列由上海吉凱基因技術有限公司設計及合成。FGL1靶點序列GAPDH序列見Tab 1。

Tab 1 The primer sequence of FGL1 and GAPDH

1.1.3儀器 超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)，恒溫水浴箱(北京醫療設備廠)，低溫高速離心機(德國Heraeus 公司)，普通離心機(德國Heraeus 公司400e型)，電泳儀(美國Bio-rad公司)，酶標儀(美國Bio-rad公司),純水器(美國 Millipore 公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人正常肺上皮BEAS-2B細胞和人肺腺癌PC-9細胞分別在含有10%胎牛血清的DMEM培養基和RPIM培養基中，置于 37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養。細胞為貼壁生長，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2CCK-8法檢測多西他賽對細胞的抑制率 將實驗分為空白對照組、陰性對照組及實驗組。空白對照組只加培養液，陰性對照組加細胞懸液不加藥，實驗組細胞培養24 h后貼壁，加入不同濃度(0、5、10、20、40、80 μmol·L-1)多西他賽分別作用于人肺腺癌PC-9細胞24 h和48 h，制備單細胞懸液，以5×104個/mL的濃度，接種于96孔培養板中，每孔200 μL(邊緣孔用無菌PBS填充)；終止試驗前4 h在每個孔內加入CCK-8(5 g·L-1)；酶標儀上測定各孔OD值(A值)。抑制率/%=[1-(藥物處理組A值-空白對照組A值)/(細胞對照組A值-空白對照組A值)]×100%。計算出半數抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)。

1.2.3蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測FGL1蛋白表達 細胞中加入適量的裂解液，裂解完全后離心，取上清，BCA 法測定蛋白濃度，蛋白液與上樣緩沖液充分混勻，100 ℃加熱10 min，每泳道加入 40 μg樣品進行8% SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜、5%脫脂牛奶封閉1 h后，FGL1和GAPDH抗體均按照1 ∶1 000稀釋，4 ℃孵育一抗過夜。4 ℃取出膜，吐溫PBS清洗，加入按照1 ∶10 000稀釋二抗(HRP 標記的二抗)，室溫孵育90 min，洗膜，化學發光法在紫外凝膠成像儀上進行拍照分析。FGL1的相對表達量通過FGL1的灰度值除以GAPDH 的灰度值計算。

1.2.4逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR) 將處于對數生長期的人肺腺癌PC-9細胞消化后接種至6孔板中，使細胞密度能夠達到80%～90%。收集細胞，使用TRIzol、氯仿和異丙醇等試劑提取總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄，FGL1和內參GAPDH的引物序列見Tab 1。以cDNA 為模板用實時熒光定量 PCR儀進行擴增，反應總體積20 μL，PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min，之后95 ℃、10 s，60 ℃退火40 min，共40個循環，每孔設置3個復孔。采用由公式Folds=2-△△CT計算目的基因相對表達量。

1.2.5細胞轉染 PC-9細胞在轉染前1 d消化收集，制備細胞懸液，接種細胞至6孔板中，使轉染細胞密度能夠達到40%～60%，實驗分為空白組(Control組)，陰性對照組(FGL1siNC組)，FGL1siRNA實驗組。空白組不經任何處理，實驗組轉染FGL1siRNA。嚴格按照lipofectamineTM2000試劑盒說明書進行siRNA轉染，用Opti-MEM(Invitrogen)轉染試劑進行轉染，于37 ℃、5% CO2轉染6 h后每組加入完全培養基，轉染48 h收集細胞。采用熒光倒置顯微鏡觀察各組轉染后細胞形態觀察其形態學變化，判斷轉染效率，通過Western-blot法驗證轉染效果。

2 結果

2.1 BEAS-2B、PC-9細胞中FGL1的差異表達以人正常肺上皮BEAS-2B細胞作為對照，通過Western blot法檢測FGL1蛋白在人肺腺癌PC-9細胞中的表達，見Fig 1。與BEAS-2B 細胞中FGL1蛋白表達量相比，PC-9 細胞FGL1相對表達量為(1.42±0.014)，明顯高于BEAS-2B細胞，差異具有顯著性(P<0.01)。

Fig 1 Differential expression of FGL1 in BEAS-2B and PC-9 A：Western blot assay was used to detect the expression difference of FGL1 protein in BEAS-2B cells and PC-9 cells; B: The relative level of FGL1 protein in BEAS-2B cells and PC-9 cells.**P<0.01 vs BEAS-2B group

2.2 不同濃度多西他賽對人肺腺癌PC-9細胞的增殖抑制作用CCK-8試劑盒檢測多西他賽對人肺腺癌PC-9細胞增殖抑制作用并計算IC50值，Fig 2結果發現，不同濃度多西他賽對PC-9細胞的增殖抑制作用呈現劑量依賴性。作用24 h時，藥物的IC50值是29.48 μmol·L-1；而作用48 h時，藥物的IC50值是5.88 μmol·L-1，提示多西他賽對PC-9細胞的增殖抑制作用可能有一定的時間依賴性。且與陰性對照組相比，差異具有顯著性(P<0.01)。

Fig 2 The inhibitory effect of docetaxel at different concentrations on PC-9 cells proliferation after 24 hours and 48 **P<0.01 vs control group

2.3 多西他賽增強人肺腺癌PC-9細胞中FGL1的表達不同濃度多西他賽作用于人肺腺癌PC-9細胞24 h后，以Western blot 法檢測FGL1蛋白的表達情況，Fig 3A、3B發現，隨著多西他賽濃度的增加，PC-9細胞中FGL1蛋白的表達水平明顯上調，且各個濃度組與對照組相比，差異均具有顯著性。進一步采用RT-PCR檢測FGL1 mRNA的表達情況(Fig 3C)。當多西他賽濃度為5 μmol·L-1時，FGL1 mRNA相對表達量為(1.08±0.023)(P<0.05); 當多西他賽濃度為40 μmol·L-1時, FGL1 mRNA相對表達量為(1.62±0.013)(P<0.01)，與對照組相比差異均具有顯著性。

2.4 轉染FGL1 siRNA后對PC-9細胞中的FGL1蛋白表達的影響轉染FGL1 siRNA 48 h后，用Western blot法檢測人肺腺癌PC-9細胞中FGL1蛋白表達，見Fig 4。轉染組siRNA1的 FGL1相對表達量與陰性對照組相比降至(0.865±0.045)倍，差異無顯著性(P>0.05)；轉染組siRNA2中FGL1相對表達量與陰性對照組相比降至(0.427±0.0025)倍，差異具有顯著性(P<0.01)。選取轉染效果較好的FGL1siRNA-2序列用于后續實驗。

Fig 3 Effect of docetaxel on FGL1 expression in human lung A: The effect of docetaxel on FGL1 expression in human lung adenocarcinoma PC-9 cells by Western blot;B: The relative expression level of FGL1 protein in human lung adenocarcinoma cells PC-9 after 24 hours of docetaxel treatment; C: RT-PCR was used to detect the expression level of FGL1 mRNA in human lung adenocarcinoma PC-9 cells after docetaxel treatment.*P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.5 沉默FGL1增強人肺腺癌PC-9細胞對多西他賽敏感性的作用不同濃度(0、5、10、20、40、80 μmol·L-1)多西他賽作用于人肺腺癌PC-9細胞24 h后，用CCK-8試劑盒檢測多西他賽對人肺腺癌PC-9細胞的增殖抑制作用，見Fig 5。FGL1 siRNA組藥物IC50值為2.91 μmol·L-1,與對照組相比差異具有顯著性(P<0.01)。而FGL1siNC組細胞IC50值為29.48 μmol·L-1，與對照組相比差異也具有顯著性(P<0.01)，表明FGL1 siRNA可增加多西他賽藥物的敏感性。

Fig 4 Effect of FGL1 siRNA transfection on expression of FGL1 protein in human lung adenocarcinoma PC-9 cell A:The transfection efficiency of FGL1 siRNA was observed with Western blot analysis in PC-9 cell line;B: The relative expression level of FGL1 protein after transfection in PC-9 cell line.**P<0.01 vs FGL1 siNC group

Fig 5 Effect of FGL1 silencing on sensitivity of PC-9 cells to **P<0.01 vs control group

3 討論

惡性腫瘤已經成為嚴重威脅中國人群健康的主要公共衛生問題之一，其中肺癌位居我國惡性腫瘤發病首位[6-7]。NSCLC的二線化療標準方案包括多西他賽，其作用機理是加強微管蛋白聚合、抑制微管解聚作用，阻滯細胞于G2與M期，從而破壞腫瘤細胞的有絲分裂與增殖。多西他賽不僅可導致細胞分裂異常、紡錘體結構的損傷而引起細胞死亡[8-9]，還可以在內皮細胞內解除對肌動蛋白調節[10]，具有間接抑制血管新生功能。同時其還具有免疫調節能力，如增強腫瘤相關抗原的釋放，增加細胞的抗原呈遞和提高腫瘤細胞的免疫原性[11]。但由于目前多西他賽對NSCLC療效尚不甚滿意，因此尋找新的干預手段以提高肺癌細胞對其敏感性，可能是一種治療肺癌的新策略和研究重點。

纖維蛋白原樣蛋白1(FGL1)，也稱Hepassocin或肝細胞源性纖維蛋白原相關蛋白(HFREP-1)，是Yamamoto等[12]于1993年通過差減雜交的方法在肝癌中篩選的一種過表達基因，屬于纖維蛋白原家族，與羧基末端纖維蛋白β和γ亞基具有高氨基酸同源性，但它沒有纖維蛋白凝塊形成所必須的特征性血小板、交聯區域和凝血酶敏感結合位點。目前研究發現，FGL1 mRNA 在肺腺癌、前列腺癌和惡性黑色素瘤等多種腫瘤組織中表達均上調。此外，研究發現在小鼠腫瘤模型中體內沉默FGL1基因可促進T細胞的免疫而使腫瘤縮小，且通過基因芯片技術檢測到人肺腺癌組織中FGL1呈過表達狀態。推測FGL1是淋巴細胞活化基因3(lymphocyte-activation gene-3, LAG-3)的主要免疫抑制配體，FGL1可以通過LAG-3在體內外抑制抗原介導的T細胞應答，造成腫瘤免疫逃逸現象。此外有研究已證實FGL1在胃癌細胞和組織中高表達，且對胃癌的侵襲、遷移和增殖起促進作用[13]。Nayeb-Hashemi等[14]在肝癌研究中發現，FGL1是肝腫瘤細胞抑制因子，其丟失與分化程度低等相關[14]。但FGL1表達與化療藥物敏感性間的關系尚未見報道。本研究發現與正常肺上皮BEAS-2B細胞相比，FGL1在人肺腺癌PC-9細胞中呈高表達，通過轉染FGL1siRNA沉默FGL1表達可增加不同濃度多西他賽對人肺腺癌PC-9細胞的增殖抑制作用，且與對照組相比統計學有顯著性差異(P<0.01)，表明抑制人肺腺癌PC-9細胞中FGL1的表達有可能成為提高多西他賽藥物敏感性的有效策略。

綜上所述，FGL1在人肺腺癌PC-9細胞中呈高表達，沉默FGL1表達可增強人肺腺癌細胞PC-9對多西他賽的敏感性，抑制腫瘤細胞增殖。但FGL1對肺癌細胞凋亡、侵襲和遷移有何影響及可能的信號轉導機制仍需要進一步研究。