紅花注射液生物活性質量控制方法的建立

高天紅,董培智,樸晉華,張志偉

(山西省食品藥品檢驗所，太原 030031)

紅花注射液是紅花經提取而成的滅菌水溶液，具有活血化瘀之功效，臨床上主要用于閉塞性腦血管、冠心病和脈管炎等疾病的治療[1]，其臨床功效、作用特點和作用機制都較為明確?，F代藥理實驗表明紅花能夠減輕缺血性損傷、改善心腦血氧供應、抗心肌缺血、抗凝血、抑制血小板聚集，并具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等作用[2]，從紅花中分離得到的化學成分有醌式查爾酮苷類、黃酮類等多種活性成分。鑒于紅花成分的多樣性和藥理作用多組分、多靶點的協同性, 現行質量標準采用的形態學鑒定、化學定性鑒別、指紋圖譜及指標性成分檢測，難以揭示其全部有效成分或特征成分，也難以表征理化成分與生物活性之間的相關性。生物活性的存在是實現藥效作用的前提和基礎，為使紅花注射液質量標準能更好保證臨床使用安全有效，在理化檢測的基礎上，增加特定中藥生物活性的測定，以綜合評價其產品質量[3]。研究采用膠原-腎上腺素誘導小鼠急性腦血栓模型，以紅花注射液對小鼠的偏癱保護率作為指標來考察紅花注射液的抗血栓生物活性，為紅花注射液生物活性限值測定方法的建立提供實驗室依據。

1 材料

1.1 試劑膠原蛋白：COLLAGEN Bovine Achilles Tendon，Worthington公司，批號35E8048-C，規格1 mL：1 mg；鹽酸腎上腺素注射液：天津金耀氨基酸有限公司，規格1 mL：1 mg，批號：0808282。

膠原蛋白-腎上腺素混合溶液配制：稱取膠原蛋白15.00 mg，浸泡于10 mL生理鹽水中4 h以上，研磨至溶液呈懸浮狀態，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液；另取1 g·L-1的腎上腺素0.5 mL，加入上清液中；加生理鹽水至25 mL，制得0.6 g·L-1膠原蛋白-0.02 g·L-1腎上腺素溶液。

1.2 藥品紅花注射液：5個企業、5個批次。每支裝10 mL，山西A企業，批號：H-1；每支裝20 mL，湖北B企業，批號：H-2；每支裝20 mL，四川C企業，批號：H-3；每支裝20 mL，湖北D企業，批號：H-4；每支裝5 mL，山西E企業，批號：H-5。

1.3 實驗動物昆明種小鼠560只，清潔級，雄性，體質量(22±2)g，來源：解放軍醫科院實驗動物中心，合格證號：SCXK(京)2007-004號；山西醫科大學實驗動物中心，合格證號：醫動字第070102。BALB/C種小鼠20只，清潔級，雄性，體質量(22±2)g，來源：山西省腫瘤醫院。實驗動物使用許可證號：SCXY(晉)2009-0001，實驗前動物適應試驗室環境至少1周，自由取食、飲水，期間進行檢疫，動物室維持12 h 照明，溫度(21±4)℃，相對濕度(50±20)%。

2 方法

2.1 抗小鼠體內血栓形成試驗[4-8]

2.1.1急性缺血模型制備 將血栓誘導劑尾靜脈注射至小鼠體內(0.1 mL·10 g-1)，造成小鼠血栓模型。

2.1.2試驗方法 小鼠按體重隨機分組，每組10只，分別為對照組、紅花注射液組(10 mL·kg-1)，各組小鼠連續腹腔注射給藥，對照組給予同體積0.9%氯化鈉溶液，1 次·d-1，于末次給藥后尾靜脈注射膠原蛋白混合誘導劑造模，注射后即觀察5 min內小鼠死亡數及15 min內小鼠偏癱未恢復數，結果以卡方測驗(確切概率法)進行統計，并計算各組小鼠的偏癱恢復率及供試品對抗小鼠體內血栓形成的保護率。

2.1.3統計方法及結果判定 實驗結果采用SPSS軟件進行統計分析，動物死亡與否為計數數據，采用卡方檢驗(準確概率法) 進行統計。供試品組與對照組比較，15 min內小鼠偏癱恢復數增加并具有統計學意義，且供試品組對抗小鼠體內血栓形成的保護率不低于50%，則判定實驗結果陽性。

2.1.4造模后小鼠恢復率、保護率的計算公式

2.2 試驗系考察

2.2.1給藥周期的選擇 按2.1試驗方法，紅花注射液批號為H-1批，取昆明種小鼠40只，隨機分為4組，即紅花注射液單次給藥1 d組、多次給藥3 d組、多次給藥5 d 組和對照組，紅花注射液的給藥劑量為10 mL·kg-1(5 g生藥·kg-1)，分別于給藥 第1、3、5 d后尾靜脈注入膠原0.6 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1混合溶液0.1 mL·10 g-1，觀察5 min內小鼠死亡數及15 min內小鼠偏癱未恢復數。

2.2.2膠原蛋白-腎上腺素混合誘導劑實驗敏感劑量的選擇 按2.1試驗方法，紅花注射液批號為H-1批，取昆明種小鼠80只，紅花注射液10 mL·kg-1(5 g生藥·kg-1)連續給藥3 d后尾靜脈注入不同濃度膠原蛋白-腎上腺素混合溶液0.1 mL·10 g-1，觀察5 min內小鼠死亡數及15 min內小鼠偏癱未恢復數。

2.2.3給藥劑量及給藥后造模時間的考察

2.2.3.1正交試驗選擇最佳給藥劑量和給藥后造模時間 按2.1試驗方法，紅花注射液批號為H-1批，取昆明種小鼠100只，連續給藥3 d后尾靜脈注入膠原0.6 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1混合溶液0.1 mL·10 g-1，選用正交設計表 L9(32)，以紅花注射液不同給藥劑量及給藥后造模時間為影響因素，以供試品抗小鼠體內血栓形成的保護率為考察指標進行試驗，因素水平設計表見Tab 3。

2.2.3.2正交試驗結果驗證 由正交試驗結果分別選擇最差實驗控制條件A1B3(1.67 g·kg-1劑量；給藥后60 min造模)和最好實驗控制條件A3B2(5 g·kg-1劑量；給藥后45 min造模)，取紅花注射液H-1批連續給藥3 d，末次給藥45 min后尾靜脈注入膠原0.6 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1混合溶液0.1 mL·10 g-1，按2.1試驗方法進行重復。

2.2.4不同品系小鼠的考察 按2.1試驗方法，紅花注射液批號為H-1批，取昆明種、BALB/C 小鼠各20只，紅花注射液5 g生藥·kg-1劑量給藥3 d，末次給藥后45 min尾靜脈注入膠原0.6 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1混合溶液0.1 mL·10 g-1，即刻觀察5 min內小鼠死亡數及15 min內小鼠偏癱未恢復數，比較不同品系小鼠對試驗結果的影響。

2.2.5試驗系的確定 依照試驗系考察結果，確定試驗最佳條件。

2.3 方法學驗證[9-11]

2.3.1重復性考察 取紅花注射液H-1批，按2.1試驗方法和2.2.5確定的試驗條件重復6次試驗。

2.3.2中間精密度考察 取紅花注射液H-1批，分別改變實驗室內部條件(不同人員、不同工作日和試驗時間)，按2.1試驗方法和2.2.5確定的試驗條件進行試驗。

2.3.3重現性考察 取紅花注射液H-1批，按2.1試驗方法和2.2.5確定的試驗條件分別在不同實驗室進行試驗。

2.4 不同批號紅花注射液抗血栓活性的考察取5批紅花注射液，按2.1試驗方法和2.2.5確定的試驗條件進行試驗。

3 結果

3.1 試驗系的考察

3.1.1給藥周期的選擇 Tab 1結果顯示，造模后對照組小鼠10只死亡，死亡率100%，各紅花注射液給藥組小鼠死亡數減少、15 min偏癱恢復數增加，單次給藥1 d組恢復1只小鼠、保護率為10%,多次給藥3 d組和多次給藥5 d 組分別恢復6只、7只小鼠、保護率分別為60%、70%，與對照組比較差異有顯著性(P<0.01)。

Tab 1 Effect of administration cycle on test results

**P<0.01vscontrol

3.1.2膠原蛋白—腎上腺素混合誘導劑實驗敏感劑量的選擇 Tab 2結果顯示，隨混合誘導劑劑量降低，對照組小鼠死亡數減少、15 min偏癱恢復數增加，紅花注射液各誘導劑組小鼠恢復數基本一致。與同誘導劑劑量對照組相比，紅花注射液膠原0.60 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1誘導組、膠原0.54 g·L-1-腎上腺素0.018 g·L-1誘導組和膠原0.48 mg·L-1-腎上腺素0.016 g·L-1誘導組小鼠的偏癱恢復數有顯著性差異(P<0.05或0.01)；膠原0.42 g·L-1-腎上腺素0.014 g·L-1誘導組小鼠恢復數與其他組基本一致，與同誘導劑劑量對照組比較沒有差異，保護率為33%。

Tab 2 Effects of different doses of inducer on test results(n=10)

**P<0.01vscontrol；*P<0.05vscontrol

3.1.3給藥劑量及給藥后時間的考察

3.1.3.1正交試驗選擇最佳的給藥劑量和給藥后造模時間 Tab 4、5結果顯示，給藥劑量和給藥后造模時間對抗小鼠體內血栓形成的保護率均有明顯影響(P<0.05)，影響的主次順序為給藥劑量>給藥后造模時間。經方差分析，給藥劑量三水平之間差異明顯，給藥后造模時間三水平之間差異明顯。直接觀察9組數據，最好試驗條件為8號(A3B2)、其保護率為78%，最差試驗條件分別為1號(A1B1)、3號(A1B3)和6號(A2B3)，保護率為11%。經計算分析最佳試驗條件為A3B2，即小鼠以5 g·kg-1劑量腹腔注射給藥，并于給藥后45 min尾靜脈注射膠原-腎上腺素誘導造模；最差試驗條件為A1B3，即小鼠以1.67 g·kg-1劑量腹腔注射給藥，并于給藥后60 min尾靜脈注射膠原-腎上腺素誘導造模。直接觀察與計算結果一致。

Tab 3 L9(32) Table of factor-level

Tab 4 Direct-viewing analysis of Orthogonal experiment

**P<0.01vscontrol；*P<0.05vscontrol

Tab 5 Variance analysis of orthogonal experiment

3.1.3.2正交試驗結果驗證 Tab 6驗證結果與正交試驗結果相符，在A1B3試驗條件下小鼠偏癱恢復3只，與對照組相比沒有顯著差異，保護率為13%；在A3B2(5 g·kg-1劑量；給藥后45 min造模)試驗條件下小鼠偏癱恢復7只，與對照組相比有顯著差異性(P<0.05)，保護率為63%。

Tab 6 Verification of orthogonal experiment

*P<0.05vscontrol

3.1.4不同品系小鼠的考察 紅花注射液對遠交群(昆明種)和近交系(BALB/C)小鼠體內血栓形成有明顯的保護作用(P<0.05)，小鼠偏癱恢復數與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)，保護率分別為55%和62%。

3.1.5確定試驗系 取健康合格，體質量(20～24) g，同一來源的昆明種雄性小鼠，按體重隨機分為2組，每組不少于10只。每日于大致相同的時間分別給每鼠腹腔注射0.1 mL·10 g-1(5.0 g生藥·kg-1)紅花注射液或等體積0.9%氯化鈉溶液，每日1次，連續注入3次，于末次注入45 min后尾靜脈注射膠原0.60 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1造成小鼠急性腦血栓模型，即刻觀察5 min內小鼠死亡數及15 min內小鼠偏癱未恢復數，采用卡方檢驗(準確概率法)進行統計，計算各組小鼠的偏癱恢復率及供試品對小鼠體內血栓的保護率。對照組動物偏癱恢復率控制在不大于20%條件下，供試品組與對照組比較，小鼠偏癱恢復數增加并具有統計學意義，且供試品組體內血栓形成的保護率不低于50%，則判定實驗結果陽性。以紅花注射液5.0 g生藥·kg-1劑量作為生物活性試驗的檢測限值。

3.2 方法學驗證

3.2.1重復性考察 Tab 8結果顯示，6次試驗對照組動物偏癱恢復率均不大于20%，供試品組與對照組相比小鼠偏癱恢復數差異有顯著性(P<0.05或0.01)，保護率均不低于50%，以保護率計算RSD值，為10.0%，重復性較好。

Tab 7 Effect of different strains of mice on test results

*P<0.05vscontrol

**P<0.01vscontrol；*P<0.05vscontrol

3.2.2中間精密度考察 Tab 9結果顯示，A、B、C三位實驗人員、分別在第1、8、15工作日的不同工作時間進行試驗，各對照組動物偏癱恢復率均不大于20%，各供試品組與對照組相比小鼠偏癱恢復數差異有顯著性(P<0.05或0.01)，保護率均不低于50%，中間精密度較好。

Tab 9 Intermediate precision inspection test results

*P<0.05vscontrol,**P<0.01vscontrol

3.2.3重現性考察 Tab 10結果顯示，在不同實驗室分別進行試驗，各對照組動物偏癱恢復率均不大于20%，各供試品組與對照組相比小鼠偏癱恢復數差異有顯著性(P<0.05或0.01)，保護率均不低于50%，重現性較好。

Tab 10 Reproducibility inspection test results

*P<0.05vscontrol,**P<0.01vscontrol

Tab 11 Experimental results of acute cerebral thrombosis in mice

*P<0.05vscontrol,**P<0.01vscontrol

3.3 不同批號紅花注射液抗血栓活性的考察5批紅花注射液中，H-1、H-2、H-4批樣品小鼠15 min偏癱恢復數明顯增加，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05或0.01)，保護率為52%、71%、62%，表明H-1、H-2、H-4批樣品對膠原-腎上腺素誘導的體內血栓小鼠有顯著的保護作用，H-3、H-5批樣品也可增加小鼠偏癱恢復數，但與對照組比較差異沒有顯著性，保護率為24%和38%。

4 討論

膠原蛋白和腎上腺素均為血小板聚集誘導劑，合用有顯著的協同作用，二者小劑量混合，靜脈注射可誘發小鼠血栓性偏癱和死亡[4]；紅花注射液具有活血化瘀的功效，可抑制血小板聚集，拮抗由該模型誘導的小鼠血栓性偏癱和死亡。該模型動物廉價易得、誘導劑使用劑量小、操作簡單易行，整體試驗條件和環境易于控制、具有較好的重復性,符合中藥生物活性測定的基本原則。在前期的藥物篩選試驗中，紅花注射液對膠原-腎上腺素誘導的小鼠體內血栓模型比較敏感，能夠表達出不同企業之間和同一企業不同批號之間的活性差異。因此進一步探討作為紅花注射液生物活性的評價指標。

誘導劑劑量是試驗系的影響因素之一：誘導劑劑量過大，小鼠死亡數多、偏癱難以恢復，無法體現藥物的保護作用；誘導劑劑量過小，則小鼠偏癱模型不明顯，難以判斷是藥物的保護作用還是動物機體的自身抵抗，無法計算藥物對小鼠偏癱的保護率。試驗過程發現不同來源和批次的同品系小鼠對膠原-腎上腺素混合誘導劑的敏感性也有差異。為使誘導劑能引起大多數正常小鼠血栓性偏癱，且引起的血栓性偏癱程度在藥物的保護范圍，應使對照組動物偏癱恢復率控制在不大于20%的范圍內。試驗確定的膠原-腎上腺素混合誘導劑參考劑量范圍在膠原0.6 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1～膠原0.54 g·L-1-腎上腺素0.018 g·L-1之間，以膠原0.6 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1為宜。

紅花注射液對膠原-腎上腺素誘導的昆明種小鼠和BALB/C小鼠體內血栓模型均有保護作用，其中昆明種小鼠為遠交群，相對于近交系 BALB/C 小鼠出籠量大、抗病力強、環境適應力強，在試驗過程中能經受多次給藥等操作刺激，且價格便宜，因此選擇昆明種小鼠為實驗動物。連續給藥3 d和5 d后紅花注射液對急性腦血栓小鼠均有顯著保護作用，考慮到經濟、快捷，選擇3 d為試驗給藥周期。

選用兩因素三水平正交設計表L9(32)，給藥劑量為主要因素，給藥后造模時間為次要因素，二者三水平之間差異顯著。相同給藥后造模時間對急性血栓小鼠的保護作用與劑量呈正相關。有研究報道紅花中色素類成分在抑制血小板聚集的同時對已聚集的血小板有非常明顯的解聚作用，且隨劑量的增加而逐漸增強[12]。

考察5家不同企業的5批紅花注射液生物活性，對膠原-腎上腺素誘導的小鼠體內血栓保護率分別為52%、71%、24%、62%、38%，其中H-1、H-2、H-4批樣品對膠原-腎上腺素誘導的小鼠偏癱恢復有顯著性差異(P<0.05或0.01)，顯示5個不同企業的紅花注射液生物質量有差異，膠原-腎上腺素誘導的小鼠體內血栓模型可對這種差異進行區分。紅花注射液各企業間生產工藝存在不同，藥效物質羥基紅花黃色素A對熱不穩定,各企業半成品、成品的滅菌溫度與時間差別較大, 可能是造成樣品生物活性差別的原因之一。應進一步積累數據，為紅花注射液生物活性限值測定方法的建立提供實驗室依據，作為紅花注射液現行質量標準的有益補充，以期對紅花注射液的質量屬性進行綜合評價。并經系統對中藥生物活性限值測定法的開發、建立和應用，為中藥制劑質量生物評價提供研究方法和思路。