西黃丸對大鼠乳腺上皮細胞凋亡及ER、PR表達的影響

劉景楠，趙 敏，吳平安，韓 宇，韓 濤

(1. 甘肅中醫藥大學藥學院中藥學教研室，甘肅 蘭州 730000；2.華中科技大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢 430074)

乳腺增生是一種臨床常見的乳腺良性病變，作為女性乳腺疾病的高發疾病，近年來發病齡逐漸年輕化，發病率逐年升高[1]。該病發展過程遵循“正常組織-單純性增生(輕、中、重度)-非典型性增生-原位癌-浸潤性癌”的規律[2]。且研究發現，乳腺增生癥與乳腺癌的發生具有相關性[3]。在乳腺癌發病每年近百萬患者的情形下[4]，對乳腺增生患者進行及時、有效的診斷與治療具有重要臨床意義。

西黃丸又名犀黃丸，出自清代名醫王洪緒所著《外科證治全生集·卷四》[5],作為現代臨床治療乳腺癌的常用藥之一。課題組前期基于下丘腦-垂體-卵巢軸對西黃丸進行了在體動物實驗研究，發現西黃丸具有抗乳腺增生作用[6]。通過對軸上FSH、LH等激素及GPR54、GnRHR等受體的調節作用來實現，但并未說明西黃丸對乳腺組織是否有直接干預作用。葉媚娜等[7]研究發現，體外培養的原代正常人乳腺上皮細胞仍具有體內細胞的二倍體遺傳特性，在體外聯合應用雌二醇和孕酮可以促進其增殖。因此，本實驗通過聯合應用E2和P促進乳腺上皮細胞增殖，擬構建體內乳腺組織良性增生模型，于體外進行西黃丸抗乳腺增生研究，為西黃丸治療乳腺增生提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞

1.1.1動物 SD大鼠，♀，未孕50只(SPF級)，體質量(200±20)g，購自甘肅中醫藥大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(甘)2015-0002。

1.1.2細胞 大鼠乳腺上皮細胞，購自賽佰康生物技術有限公司，并進行免疫熒光鑒定。將細胞接種于DMEM培養基上，于5%CO2、37 ℃培養箱中培養。

1.1.3藥品與試劑 西黃丸，批號：11020073，北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，規格：每20丸重1 g；枸櫞酸他莫昔芬片，批號：31021545，揚子江藥業集團有限公司，規格：每片10 mg；黃體酮注射液，批號：131003，浙江仙琚制藥股份有限公司，規格1 mL含黃體酮20 mg;苯甲酸雌二醇注射液，批號：090801，上海通用藥業股份有限公司，規格：每1mL含雌二醇2 mg。 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，購于BD公司，批號：556547；SP檢測試劑盒，購于索萊寶公司，批號：SP0041。

1.1.4儀器 CO2培養箱，Thermo公司，型號：311；電子顯微鏡，日立公司，型號：HT7700；IMS圖像分析系統，凝膠成像儀，Azure biosystems公司，型號：C300；電泳儀，北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-24DN；Benchmark Plus酶標儀，美國伯騰儀器有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1動物分組及給藥 按隨機數字表法將大鼠分為5組，即空白組、對照組(他莫昔芬)、西黃丸高、中、低劑量組，每組10只。空白組灌胃等體積蒸餾水，對照組給予每日1.8 mg·kg-1他莫昔芬灌胃，西黃丸高、中、低劑量組分別給予每日2.16，1.08，0.54 g·kg-1西黃丸灌胃，連續7 d[8]。

1.2.2西黃丸含藥血清制備 末次灌胃后1h(灌胃前禁食12 h)，10%水合氯醛(0.3 mL/100g)腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，4 ℃離心，無菌分離血清，0.22 μm微孔濾膜濾過，置-80 ℃保存備用。

《意見》提出了實行最嚴格水資源管理制度“五個堅持”的基本原則。一是堅持以人為本，著力解決人民群眾最關心最直接最現實的水資源問題，保障飲水安全、供水安全和生態安全。二是堅持人水和諧，尊重自然規律和經濟社會發展規律，處理好水資源開發與保護關系，以水定需，量水而行，因水制宜。三是堅持統籌兼顧，協調好生活、生產和生態用水，協調好上下游、左右岸、干支流、地表水和地下水關系。四是堅持改革創新，完善水資源管理體制和機制，改進管理方式和方法。五是堅持因地制宜，實行分類指導，注重制度實施的可行性和有效性。

1.2.3細胞分組及給藥 大鼠乳腺上皮細胞的培養方法：取大鼠乳腺組織，物理剪碎法結合胰蛋白酶消化法處理組織，待消化后，加入混合培養液，培養液為89%DMEM培養基+1%青鏈霉素混合液+10%大鼠血清，前兩天每24 h換液一次，之后每隔1 d換液1次[7]。

將大鼠乳腺上皮細胞分為①空白組：乳腺上皮細胞+10%空白組血清；② 增殖組：乳腺上皮細胞+E2、P干預+10%空白組血清；③ 西黃丸高劑量組：乳腺上皮細胞+ E2、P干預+10%西黃丸高劑量組血清； ④ 西黃丸中劑量組：乳腺上皮細胞+ E2、P干預+10%西黃丸中劑量組血清；⑤ 西黃丸低劑量組：乳腺上皮細胞+ E2、P干預+10%西黃丸低劑量組血清；⑥ 他莫昔芬組：乳腺上皮細胞+ E2、P干預+10%對照組血清。

1.2.4免疫熒光鑒定原代培養的乳腺上皮細胞 細胞爬片，固定，封閉，一抗孵育，二抗孵育，滴加一滴Fluoromount-G熒光封片劑，包埋。

1.2.5CCK-8法檢測大鼠乳腺上皮細胞增殖最佳培養濃度 用無水乙醇將E2、P、E2+P配制成1 g·L-1的母液，之后用生長培養基分別稀釋成0.1、10-2、10-3、10-4、10-5g·L-15種濃度[6]。以無水乙醇與生長培養基作為空白組，以加入等量無水乙醇與生長培養基的大鼠乳腺上皮細胞為對照組，每組設5個復孔，采用CCK-8法檢測各濃度藥物培養液下各組乳腺上皮細胞增殖情況，得到其增殖最佳濃度藥物培養液為E2+P混合培養液(濃度為0.1 g·L-1)。

1.2.6CCK-8法檢測給予西黃丸后大鼠乳腺上皮細胞的存活率 采用CCK-8法檢測給予西黃丸后各組乳腺上皮細胞于第24 h、48 h、72 h的存活率。細胞存活率/%=(實驗組/增殖組-1)×100%

1.2.7Giemsa染色法進行西黃丸干預后大鼠乳腺上皮形態學觀察 取各組對數生長期的細胞，細胞爬片，滴加瑞式-吉姆薩染液2～3滴覆蓋整個標本，2 min后滴加等量pH 6.4的磷酸緩沖液，充分混勻，水洗、吸干、鏡檢。

1.2.8流式細胞儀檢測給予西黃丸后大鼠乳腺上皮凋亡率 收集大鼠乳腺上皮細胞，PBS洗滌，冰預冷的70%乙醇固定，將細胞重懸于200 μL binging buffer，400目篩網過濾離心，染色，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒嚴格操作，于流式細胞儀上進行檢測，使用CYEXPERT分析軟件進行結果分析。

1.2.9免疫組化法檢測給予西黃丸后大鼠乳腺上皮細胞凋亡因子表達 采用SP試劑盒進行檢測，細胞爬片固定后，PBS漂洗兩次，加入0.5%Triton X-100室溫孵育20 min，PBS漂洗兩次，加入3%H2O2處理15 min，PBS漂洗。吸去上清液，血清室溫封閉20 min，一抗、二抗孵育，DAB顯色，蒸餾水洗滌終止反應，蘇木素復染，封片，顯微鏡觀察[8]。

1.2.10蛋白免疫印跡技術測定蛋白表達 Western blot法測定乳腺上皮細胞雌二醇受體α(estradiol receptorα，ER-α)、雌二醇受體β(estradiol receptor β，ER-β)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)蛋白表達水平。待細胞密度生長至80%，提取細胞蛋白，繪制標準曲線進行蛋白定量。制膠，室溫下電泳，將蛋白分離并轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉進行膜的封閉，抗體孵育，ECL顯色，拍照，ImageJ軟件分析。

2 結果

2.1 原代培養正常大鼠乳腺上皮細胞的鑒定結果如下圖所示，均為陰性表達，經免疫熒光鑒定，細胞為原代大鼠乳腺上皮細胞，純度達到90%以上。

Tab 1 Effect of estradiol and progesterone on inhibition of normal rat mammary epithelialcells in primary

*P<0.05vsmultiple comparisons

2.2 E2、P干預下原代培養正常大鼠乳腺上皮細胞最佳增殖濃度結果如Tab 1所示，原代培養的正常大鼠乳腺上皮細胞增殖實驗結果為E2+P混合培養液組(E2、P濃度為10-1g·L-1)時OD值最大，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 西黃丸對大鼠乳腺上皮細胞存活率影響結果如Tab 2所示，與增殖組比較，對照組，西黃丸高、中、低劑量組OD值均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。西黃丸高、中、低劑量組及他莫昔芬組均對E2、P誘導的大鼠乳腺上皮細胞有明顯抑制作用，且隨著時間延長，抑制率逐漸升高，西黃丸高劑量組于72 h抑制率達到最高。

Tab 2 Effect of Xihuang pills on proliferation of normal rat mammary epithelialcells in primary

**P<0.01vsproliferation

2.4 西黃丸干預下大鼠乳腺上皮細胞形態學觀察結果如Fig 2所示，活細胞為淡紫色，凋亡細胞為深藍色，結果可見空白組及增殖組多為淡紫色，可見淡紫色細胞核，而西黃丸高劑量組及對照組多為深藍色染色，且未能觀察到細胞核，即凋亡細胞。

2.5 西黃丸對大鼠乳腺上皮細胞凋亡率影響結果如Fig 3所示，經PI染色后，乳腺上皮細胞細胞核為紅色，正常細胞分布于B3下左區，B2與B4區主要為凋亡細胞，由圖可以得出，西黃丸高、中、低劑量組及對照組均會促進E2、P干預的大鼠乳腺上皮細胞凋亡，且主要影響乳腺上皮細胞的晚期凋亡，以西黃丸高劑量組影響最明顯，凋亡率為43.79%。

2.6 西黃丸對大鼠乳腺上皮細胞凋亡因子表達的影響結果如Fig 4、5及Tab 4所示，正常生長的大鼠乳腺上皮細胞為藍紫色，凋亡細胞在光學顯微鏡下陽性表達為棕黃色，結合光密度值來看，Fig 4中西黃丸高、中劑量組陽性表達最為顯著(P<0.01)，即西黃丸可促進Bax的表達；Fig 5中西黃丸高、中劑量組及對照組多為藍紫色，即抑制Bcl-2的表達(P<0.01)。故西黃丸可通過改變Bax/ Bcl-2來促進大鼠乳腺上皮細胞凋亡。

Fig 2 Morphological observation of rat mammary epithelial cells treated with Xihuang pills(×200)Rat mammary epithelial cells stained with Giemsa:A:Blank group,B:Proliferation group,C:Control group,D:Experimental-H group, E:Experimental-M group, F:Experimental-L group,in which dark blue indicates apoptotic cells.

Tab 3 Effect of Xihuang pills onapoptotic rate of normal rat mammary epithelial cells in primary

**P<0.01vsproliferation

Fig 3 Effect of Xihuang pills on apoptotic rate of rat mammary epithelial cellsRepresentative images of flow cytometry, B1 quadrant:dead cell,B2 quadrant:late apoptotic cell,B3 quadrant: normal cell, B4 quadrant:early apoptotic cell.A:Blank group,B:Proliferation group,C:Control group,D:Experimental-H group, E:Experimental-M group, F:Experimental-L group.

Fig 4 Effect of Xihuang pills containing serumon Bax expression in proliferating mammary epithelial cells(×400)Expression of Bax protein under immunohistochemistry: A:Blank group,B:Proliferation group,C:Control group,D:Experimental-H group, E:Experimental-M group, F:Experimental-L group, in which the positive expression was brownish yellow.

Tab 4 Effect of Xihuang pills on Bax and Bcl-2 expression in primarily cultured rat mammary epithelial

2.7 西黃丸對大鼠乳腺上皮細胞ERα、ERβ、PR蛋白表達的影響結果如Fig 6所示，與空白組比較，增殖組灰度值差異具有顯著性(P<0.01)，說明E2、P可增加正常乳腺上皮細胞ERα、ERβ、PR表達；而增殖組與西黃丸高、中、低劑量組及對照組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，說明西黃丸含藥血清各劑量組及他莫昔芬組均對ERα、ERβ、PR表達有抑制作用。以ERα、ERβ灰度值看，對照組的抑制作用優于西黃丸高劑量組，即可有效抑制乳腺組織增生，以PR看，抑制作用亦高于西黃丸高劑量組，即不利于乳腺組織的復舊。

3 討論

細胞凋亡是指為維護內環境穩定，由基因控制的細胞自主有序的死亡，對機體正常發育、維護內環境穩態有重要的作用[9]。乳腺增生的發病、加重、甚至癌變的過程就是乳腺上皮細胞增殖過度及凋亡減弱的結果。而乳腺細胞凋亡和增殖過程是由生長因子和營養激素相互調節的。研究表明，乳腺增生的發病與E2/P直接相關，ER過度表達導致乳腺上皮細胞及間質纖維出現增生，使乳腺上皮細胞的修復能力減弱。PR的過度表達可誘導乳腺上皮細胞的形態發生改變，可激活特異性生長因子，使乳腺上皮細胞對P的應答出現異常，進而影響乳腺組織的復舊[10]。實驗結果表明，西黃丸可有效抑制ER、PR的表達，改變ER/PR，從而改變乳腺組織的增生與復舊。

Fig 5 Effect of Xihuang pills containing serum on Bcl-2 expressionin proliferating mammary epithelial cells(×400)Expression of Bcl-2 protein under immunohistochemistry: A:Blank group,B:Proliferation group,C:Control group,D:Experimental-H group, E:Experimental-M group, F:Experimental-L group, in which the positive expression was brownish yellow.

線粒體作為誘導細胞凋亡的核心。 Behera等[11]研究發現，孕激素能通過Fas L途徑激活誘導的細胞凋亡。Simpkins等[12]研究表明，雌激素對線粒體功能有顯著影響，并將雌激素受體ER定位于線粒體內。有研究認為，E2通過膜受體ER或線粒體受體ER在乳腺細胞中通過與線粒體呼吸復合物(MRC)的直接相互作用產生ROS導致蛋白激酶活化而改變線粒體，從而導致細胞凋亡[13]。本實驗對調節線粒體介導細胞凋亡的Bcl-2家族成員進行研究，發現西黃丸通過上調抗細胞凋亡蛋白Bax/促細胞凋亡蛋白Bcl-2的轉錄來促進乳腺細胞凋亡，其結果可能與E2直接調節Bcl-2家族有關。

Fig 6 Effect of Xihuang pills on expression of ER-α,ER-β and PR protein in rat mammary epithelial cellsGray value strip chart of ER-α,ER-β and PR by Western blot;Gray value histogram of ER-α,ER-β and PR.**P<0.01 vs proliferation

綜上所述，西黃丸能通過抑制ER、PR的表達,從線粒體途徑誘導乳腺上皮細胞凋亡，抑制其增殖，對乳腺增生有顯著的療效。而Bcl-2、Bax作為促凋亡因子，能誘導細胞色素C釋放和凋亡小體的形成。因而本課題組下一階段將針對線粒體、mtDNA、雌激素、ER在乳腺增生中的關系，從細胞色素C入手進行下一步實驗。