基于藥代動力學的山豆根抗炎作用機制研究

航 艾，孫 杰，盛云華，寧 煉，唐黎明,金若敏

(1.上海市食品藥品檢驗所藥理毒理室/藥物安全評價中心，2.上海中醫藥大學藥物安全評價研究中心，上海 201203)

山豆根(Radix etRhizomeSophoraeTonkinensis, RRST)，為豆科植物越南槐(SophoratonkinensisGane)的干燥根和根莖，主要產于廣西和貴州等地，其運用歷史已超過千年。山豆根藥性苦寒，有毒，歸肺、胃經，功效清熱解毒，消腫利咽[1]，具有較好的抗炎作用。化學成分分析結果表明，山豆根主要含有苦參堿(matrine)及氧化苦參堿(oxymatrine)等生物堿[2]，已有文獻報道山豆根對小鼠耳腫脹可以顯著抑制急性炎癥引起的毛細血管通透性增高、炎性滲出及組織水腫，對大鼠肉芽腫炎癥后期肉芽組織的增生有較好的抑制作用，這表明山豆根中所含生物堿具有直接抗炎作用[3]。

本研究采用角叉菜膠致大鼠足跖腫脹試驗觀察山豆根的抗炎作用時-效關系，并同時檢測其對炎癥因子水平的影響，探討山豆根水提物抗炎的作用及與苦參堿體內血藥濃度變化的相關性。

1 材料與方法

1.1 動物及飼養條件SPF級SD大鼠，雄性，體質量(150～180) g，購自浙江維通利華試驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(浙)2018-0001，動物合格證號：33000800002240，質量檢測單位：北京維通利華試驗動物技術有限公司。飼養環境普通級，溫度(20～24) ℃，相對濕度40%～70%，適應性飼養3 d后進行試驗。本試驗動物飼養于上海市食品藥品檢驗所動物房。

1.2 藥物、試劑及配制山豆根，購自廣西宏锃藥業有限公司，產地：廣西靖西縣，批號：20190307。山豆根水提浸膏粉由上海中藥制藥技術有限公司提取：以藥材 ∶水=1 ∶6的比例加水浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮1 h，用200目篩網過濾藥渣，收集濾液。藥渣同前煎煮再次收集濾液。濾液70 ℃旋轉蒸發濃縮至略微粘稠狀，75 ℃真空干燥，得浸膏粉，每克浸膏粉相當于6.657 g生藥，經檢測其中苦參堿含量為2.17%，氧化苦參堿含量為2.69%。氫化可的松(中國食品藥品檢定研究院，規格：約50 mg/瓶，批號100152-201707)；角叉菜膠(生產商：Sigma-Aldrich，CAS：9000-07-1，批號：SLBL6067V)；TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA 試劑盒，購自信裕生物科技有限公司(批號：TNF-α XY-E30635, IL-1β XY-E30419, IL-6 XY-E30646)；苦參堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110805-201709)；西咪替丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100158-201406)；甲酸和乙腈為色譜純，超純水為實驗室自制。

1.3 儀器自制足跖容積測量儀；API 5000 LC/MS/MS 三重四級桿液質聯用儀(AB SCIEX)，酶標分析儀(DNM9602，北京普朗技術有限公司)。

1.4 方法

1.4.1山豆根對大鼠足跖腫脹的抗炎作用 取雄性SD大鼠44只，分為4組，分別為空白對照組(Control)、氫化可的松組(Hydrocortisone)、山豆根水提浸膏粉高劑量組(RRST-H)和低劑量組(RRST-L)。氫化可的松組灌胃給予40 mg·kg-1氫化可的松，山豆根水提浸膏粉高、低劑量組分別灌胃給予生藥0.6 g·kg-1和生藥0.3 g·kg-1山豆根水提浸膏粉溶液，給藥體積為20 mL·kg-1，空白對照組給予同體積純水,每日給藥1次，連續3日。

末次給藥后1 h，大鼠右后足跖皮下注射質量分數為1%的角叉菜膠溶液0.1 mL致炎，測定致炎前和致炎后0.5、1、2與3 h時的大鼠右后足跖容積，并計算腫脹率，腫脹度與腫脹率計算公式如下：

腫脹度=致炎后足跖容積-致炎前足跖容積

腫脹率/%=腫脹值/致炎前足跖容積×100%。

末次測定足跖容積后，各組大鼠致炎側后足自踝關節上5 mm處截取足爪組織制備勻漿液，按ELISA試劑盒說明書檢測致炎組織中的炎癥因子：TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

1.4.2山豆根藥代動力學參數 取雄性SD大鼠10只，分為2組，分別為山豆根水提浸膏粉高劑量組和低劑量組。給藥劑量、給藥周期同抗炎作用試驗，于末次給藥前和給藥后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8和24 h，經眼眶后靜脈叢取血約0.5 mL，EDTA-2K抗凝管4 ℃離心(3 000 r·min-1，15 min)，分取血漿,采用LC/MS/MS檢測山豆根抗炎作用伴隨藥代動力學研究藥代參數AUC(0-t)、Cmax、Tmax、T1/2。

色譜分析條件 Waters XBridge Amide色譜柱(4.6×100 mm，3.5 μm)，0.1%甲酸溶液- 乙腈=60：40(V/V)為流動相；柱溫40 ℃；流速0.5 mL·min-1；自動進樣器溫度設置為10 ℃；進樣量2 μL。

質譜分析條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正離子方式監測。離子源噴霧電壓(IS)：5 500 V；溫度：450 ℃；源內氣體1(GS1，N2)壓力：45 psi；氣體2(GS2，N2)壓力： 45 psi；氣簾氣體(N2)壓力：30 psi；碰撞氣(CAD，N2)壓力：4；掃描方式為多反應監測(MRM)；用于定量分析的離子反應分別為m/z 249.3→m/z 148.2(苦參堿)、m/z 265.1→m/z 247.1氧化苦參堿和m/z 253.1→m/z 159.1(內標)，去簇電壓(DP)為140 V，射入電壓(EP)為10 V，碰撞能量(CE)分別為46 eV(苦參堿)、40 eV(氧化苦參堿)和20 eV(內標)，碰撞室射出電壓(CXP)為20 V。

血漿樣品的處理 取血漿100 μL，加入西咪替丁內標溶液(1 mg·L-1)10 μL，加入乙腈300 μL，渦旋3 min，20 000 r·min-1離心10 min。取上清200 μL進樣。

2 結果

2.1 動物體質量及一般癥狀試驗期間各組動物活動均正常，未見異常體征及動物死亡。動物初始體質量、終末體質量組間均未見顯著性差異，見Tab 1。

Tab 1 Effect of RRST on weight of

2.2 抗炎作用致炎之前，各組大鼠足跖基礎容積組間比較差異無統計學意義。致炎后，與空白對照組相比，氫化可的松組大鼠在0.5、1、2和3 h時的足跖腫脹率明顯降低(P<0.01)；山豆根水提浸膏粉高劑量組和低劑量組大鼠在0.5、1、2和3 h時的足跖腫脹率亦明顯降低(P<0.05)，見Tab 2。

Tab 2 Effect of RRST on paw edema induced by carrageenan in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 藥代動力學參數山豆根水提浸膏粉高低劑量組大鼠體內苦參堿含量呈劑量依賴性，高劑量組大鼠體內苦參堿AUC值約為低劑量組大鼠體內AUC值的兩倍，Tmax為1 h左右，半衰期為2 h左右，24 h體內苦參堿消失殆盡，見Tab 3。

Tab 3 Anti-inflammatory effect of RRST based on pharmacokinetic

2.4 山豆根對質量分數為1%的角叉菜膠致大鼠足跖腫脹組織TNF-α、IL-6及IL-1水平的影響與空白對照組比較，氫化可的松組、山豆根水提浸膏粉高、低劑量組大鼠足跖腫脹組織的TNF-α及IL-1β水平均明顯降低(P<0.01)；氫化可的松組和山豆根水提浸膏粉高劑量組大鼠足跖腫脹組織IL-6水平顯著降低(P<0.01)，見Tab 4。

Tab 4 Effect of RRST on content of TNF-α, IL-1β and IL-6 in inflammatory tissues induced by

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 討論

山豆根為使用歷史悠久的傳統中藥材，因其豐富的藥用功能備受關注。山豆根臨床常用于預防及治療咽喉炎、扁桃體炎等疾病[4]，亦可以用于治療慢性乙型肝炎、慢性活動性肝炎及肝癌的輔助性治療[5]。山豆根治療咽喉疾病及發揮保肝藥效均與其調節炎癥因子的表達有關[6]。在抗炎作用研究方面，已有文獻報道山豆根對多種炎癥模型均顯示明顯的抑制作用，如山豆根對二甲苯致小鼠耳腫脹模型能明顯降低耳腫脹度，對巴豆油所致小鼠耳腫脹和瓊脂所致小鼠肉芽腫亦有較強的抑制作用[7]，對小鼠腹腔毛細血管通透性以及組織胺所致的大鼠皮膚毛細血管通透性模型均有明顯的抑制作用[8]。但山豆根對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹模型的抗炎藥效未見報道。

山豆根的化學成分主要有生物堿、多糖、黃酮類化合物[9-10]，其中生物堿是山豆根的主要活性成分[2]，包括苦參堿、氧化苦參堿及槐果堿。有文獻已報道山豆根化學成分苦參堿、氧化苦參堿在大鼠、犬、食蟹猴體內的藥代動力學特征[11-13]，但上述藥代動力學研究均是以苦參堿和/或氧化苦參堿單體成分進行的體內藥代動力學研究，未見山豆根提取物混合組分進行的藥代動力學特征研究。另外，本研究結合山豆根抗炎藥效同步進行藥代動力學研究，基于血漿苦參堿和氧化苦參堿血藥濃度的變化考察山豆根抗炎藥效時-效關系，同時，考察山豆根發揮抗炎藥效作用時炎癥因子的表達，形成“抗炎藥效-血藥濃度-炎癥機制”三維整合研究的新思路，揭示山豆根發揮抗炎藥效的時效關系作用機制。

本研究采用角叉菜膠致大鼠足趾腫脹考察山豆根的抗炎作用。2015版《中國藥典》一部中，山豆根臨床用量為3～6 g[1]，按成人平均體重60 kg計算，人臨床用藥量為0.05～0.1 g·kg-1，大鼠等效劑量為0.3～0.6 g·kg-1。本研究動物試驗藥效劑量設計以《中國藥典》人臨床日用劑量上下線的等效劑量作為大鼠藥效高、低兩個劑量，通過測定大鼠足跖腫脹率，結果顯示上述等效劑量范圍內的山豆根水提浸膏粉均可明顯抑制角叉菜膠致大鼠足跖的腫脹度。

在山豆根抗炎作用時-效關系研究中，氫化可的松組在角叉菜膠致炎后0.5、1、2與3 h時大鼠腫脹率非常顯著降低，山豆根水提浸膏粉高、低劑量組亦在致炎后0.5、1、2與3 h時大鼠腫脹率顯著降低，顯示山豆根水提浸膏粉高、低劑量組均具有較強的抗炎作用，且高劑量抗炎作用強于低劑量。在抗炎藥效同步進行的藥代動力學研究中，本研究檢測了血漿苦參堿和氧化苦參堿的血藥濃度，結果發現氧化苦參堿體內血藥濃度較低，接近生物分析定量限，結合本研究檢測山豆根藥材中苦參堿含量為2.17%，氧化苦參堿含量為2.69%，兩個成分含量均較低，吸收入血后，根據文獻報道氧化苦參堿可在腸道菌的作用下代謝為更易吸收的苦參堿，苦參堿有著較高的生物利用度，較易吸收入血[13,14]，體內氧化苦參堿的含量會進一步降低，其檢測結果接近生物分析定量限，存在定量不準確的因素，因此本研究藥代動力學參數的統計以苦參堿計。藥代動力學參數結果顯示山豆根水提浸膏粉高劑量組大鼠體內苦參堿AUC值約為低劑量組的兩倍，且高劑量組對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹率的抑制作用明顯強于低劑量組；大鼠體內苦參堿Tmax為1 h左右，山豆根水提浸膏粉組大鼠足跖腫脹率也于1 h左右達到高峰后開始下降，說明山豆根水提浸膏粉對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹率的影響與大鼠體內苦參堿血藥濃度具有高度相關性，提示苦參堿可以作為山豆根水提浸膏粉抗炎作用的標志性物質。

在抗炎作用炎癥因子的檢測中，本研究對末次測定足趾容積后腫脹組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量進行了測定。細胞因子是由多種組織細胞所合成和分泌的具有生物活性的小分子多肽或糖蛋白，主要包括腫瘤壞死因子和白細胞介素等[15]。TNF-α不僅具有很強的致炎活性，還可以刺激受損傷的組織細胞釋放白細胞介素等炎癥因子，進而誘導并放大損傷的炎癥反應[16]。早期炎癥的致炎因子IL-1β可以與TNF-α 共同激活諸多免疫和炎癥細胞，促進炎癥的進一步發展，進而調控和誘導其他炎癥因子的分泌與釋放。IL-6具有多種功能, 如調節免疫系統、造血系統, 參與急性相反應及炎癥反應過程，易被一系列炎癥刺激及炎癥介質所誘導, 如TNF-α和IL-1 等，也是參與先天免疫(非條件免疫)的一種重要炎癥介質。本研究發現，經角叉菜膠誘發炎癥反應后，山豆根水提浸膏粉可顯著下調致炎大鼠足跖腫脹組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，從而減輕炎癥反應的程度，且高劑量組炎癥因子的含量低于低劑量組，提示劑量越高，抑制炎癥因子的表達作用越好，抗炎作用越強，結合藥代動力學研究結果，劑量越高，體內苦參堿系統暴露量越大，抗炎作用越強。本研究從“抗炎藥效-血藥濃度-炎癥機制”三個方面整合，綜合評價山豆根抗炎藥效時效關系的作用機制，進一步明確了山豆根的抗炎作用。

本研究基于藥代動力學的藥效研究確定發揮療效的最低劑量，同理，基于毒代動力學的毒理研究確定不產生毒性的最高劑量，由此為制定“有毒”中藥的安全劑量范圍，為藥典制定“有毒”中藥可測定成分含量及推薦安全劑量提供參考，為修訂和提升“有毒”中藥材的質量評價標準提供數據依據。