血塞通注射液APTT生物活性檢測方法探索研究

樊 華,章穎慧,康 強,赫愛平,王秀英

(遼寧省檢驗檢測認證中心，沈陽 110036)

目前，絕大多數中藥制劑質量控制主要采用理化分析方法，但由于其成分多樣、工藝復雜等因素，現行質量標準中檢驗項目沒有與藥效學建立直接的內在聯系，存在一定局限性[1]。生物活性測定法是檢驗藥品質量的重要檢測手段之一，特別適用于具有多種活性成分或成分復雜、有效成分不清的中藥制劑。通過生物活性測定法與理化分析技術結合應用，致力于尋找一種方便快捷的方式考察血塞注射液生物活性，并通過血塞通注射液探索一條活血化瘀藥通用的生物活性檢定方法，使現有中藥質量標準的評價更全面更合理。

1 材料與方法

1.1 供試品和對照品血塞通注射液(A)，批號12EJ07，規格2 ml：100 mg；血塞通注射液(B)，批號20130303，規格2 ml：100 mg；血塞通注射液(C)，批號20130101，規格10 ml：250 mg。三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)(批號870-200001)、人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1，GRb)(批號110704-201223)、人參皂苷Rd(ginsenoside Rd，GRd)(批號111818-201001)，三七皂苷R1(notoginsenoside R1，NR)(批號110745-200617)、人參皂苷Re(ginsenoside Re， GRe)(批號110754-201123)、人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，GRg)(批號110703-201128)均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 試劑和儀器主要試劑:活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)測定試劑盒購自希森美康醫用電子(上海)有限公司，批號557183；氯化鈉注射液由雙鶴藥業(沈陽)有限責任公司生產，批號130718A01；檸檬酸鈉由國藥集團化學試劑有限公司生產，批號F20090828。主要儀器：全自動血凝分析儀CA-1500型由Sysmex公司生產，離心機Z323K型由德國HERMLE公司生產，十六道生理儀MP100型由BIOPAC SYSTEMS INC.公司生產。

1.3 實驗動物兔，雌雄兼用，體質量(2.5～2.9) kg，購自沈陽藥科大學，實驗動物生產許可證SCXK(遼)2014-0002，實驗動物使用許可證SYXK(遼)2013-0011。

1.4 考察血塞通注射液APTT檢測量效關系應用全自動血凝儀檢測不同企業血塞通注射液(A、B、C)(r=1 ∶0.5)不同劑量對APTT值的影響，分別取50、25、12.5、6.25、3.125 g·L-1血塞通注射液稀釋液50 μL、兔血漿50 μL、APTT試劑50 μL至血凝杯中，預熱180 s后，各杯加入CaCl250 μL，測得APTT。

1.5 考察血塞通注射液與三七總皂苷等四種標準品生物活性相關性血塞通注射液為植物三七中提取的有效部位三七總皂苷制成的滅菌水溶液，故選取三七總皂苷標準品、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1做對照，采用連續測樣和拉丁方設計等方案檢測APTT，具體實驗步驟同上。

1.6 生物活性測定方法的建立應用三七總皂苷作為對照品考察血塞通注射液對APTT的影響，選取兩批不同企業的血塞通注射液制成供試品溶液，與相應濃度的對照品溶液分別檢測APTT值，每種濃度至少4次。測得數據照生物檢定統計法(附錄ⅩⅣ)中的量反應平行線測定法計算效價及試驗誤差。

2 結果

2.1 考察血塞通注射液APTT檢測量效關系結果顯示，血塞通注射液(50、25、12.5、6.25、3.125 g·L-1)存在顯著地量效關系，且應用不同兔血漿、不同企業供試品測得的結果接近，較為穩定。初步判斷，選用APTT指標和該檢測方法控制血塞通注射液產品質量基本可行。

2.2 考察血塞通注射液與三七總皂苷等標準品的生物活性相關性實驗結果顯示，血塞通注射液與三七總皂苷存在明顯的相關性；進一步尋找哪種成分對APTT作用較強時，我們發現，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1三種標準品對應濃度APTT結果不滿意，且與血塞通注射液無相關性；同時我們發現人參皂苷Rd、人參皂苷Re應用氯化鈉注射液稀釋極難溶解，故無法進行APTT檢測。

2.3 生物活性測定方法建立測得數據依據《中國藥典》2015年版生物檢定統計法中的量反應平行線測定法計算效價及試驗誤差[2]。經生物檢定統計，血塞通注射液(20130303)測得效價是47.0 g·L-1，可信限率為6.91%，可信限范圍為43.8～50.3 g·L-1；血塞通注射液(12EJ07)測得效價是37.0 g·L-1，可信限率為8.79%，可信限范圍為33.6～40.1 g·L-1。兩批血塞通注射液三七總皂苷含量在標示量的72%～98%范圍內，與理化分析含量測定結果基本一致。

Tab 1 APTT of Xuesaitong injection at different concentrations in different production

Tab 2 Results of APTT in Xuesaitong injection or panax notoginseng

*P<0.05vsPNS

Tab 3 Results of APTT in Xuesaitong injection or ginsenoside Rb1

Tab 4 Results of APTT in Xuesetong injection, ginsenoside Rg1 or panax notoginseng

**P<0.01vsPNS

Tab 5 Results of APTT in Xuesetong injection or notoginsenoside R1

Fig 1 Correlation of APTT values between Xuesaitong injection and standard substance at different concentrations

Tab 6 Results of APTT at different concentrations of sample and

3 討論

傳統中藥依功效可分為解表藥、清熱藥、溫里藥、活血化瘀藥、補虛藥等。其中，活血化瘀藥是臨床治療心腦血管疾病最為常用藥。研究表明，活血化瘀類藥可以改善血液粘滯性，可通過抑制凝血因子活性而抑制內外源性凝血途徑，延長凝血酶時間、凝血活酶時間和凝血酶原時間，具有明顯抗凝血作用[3-4]。血塞通注射液就是這類藥的代表，其主要功效是活血祛瘀，通脈活絡；主要用于中風偏癱、瘀血阻絡證等。血塞通注射液現執行標準通過理化檢測手段(指紋圖譜、含量測定等)對其進行質量控制，但中藥有其特殊性和復雜性，它的活性成分不一定是有效成分。所以，有必要在現有的中藥質量控制模式基礎上引入藥效檢測方法綜合評價產品質量。

近些年，很多藥品檢驗研究發現中藥質量控制中生物活性測定引入的重要性，并著手開展相關課題研究[4-7]，嘗試將一些成熟、可推廣的科學研究方法應用到藥品檢驗領域[8-9]。已研究證實，血塞通注射液的活血化瘀作用是通過同時影響內源性及外源性凝血系統實現的抗凝血作用[10-11]。因此，選用檢測APTT指標評價血塞通注射液活血化瘀作用的生物活性。需要說明的是，在標準品的選擇上，依據了現行標準理化檢測指標中的5種標準品進行試驗方法的探索，以期評價兩者間的相關性和科學性。本文試驗結果顯示，單純的人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和人參皂苷R1延長活化部分凝血活酶時間效果與血塞通注射液并沒有關聯性。說明三者不是血塞通注射液發揮延長APTT作用的有效成分；而人參皂苷Re和人參皂苷Rd由于水中溶解度小，未能檢測APTT，后兩者是否為血塞通注射液藥效有效成分還需進一步實驗研究數據驗證。

Fig 2 HPLC determination of Xuesaitong injectionA:Ginsenoside Re;B:Ginsenoside Rb1;C:Ginsenoside Rg1;D:Notoginsenoside R1;E:Panax notoginseng saponins;F:Xuesaitong injection

藥物對生物體所引起的反應隨著藥物劑量的增加產生的量反應，檢定方法應選用平行線測定法[2]；本文設計選擇量反應平行線測定(3.3)法。同時，對供試品應用法定高效液相法檢測產品含量，結果與生物活性檢測方法一致。中藥的有效性和活性研究注定不同于化學藥品的研究理念，單純的成分檢測遠遠不夠，常常是有效成分的含量檢測結果與藥效結果不一致。從質量控制的方向來看，該研究考察的是產品臨床實際應用效果，與理化分析中成分檢測相比，更直接準確體現產品質量。需要注意的是，生物檢測試驗結果的精確性有別于理化試驗，受多種因素(如實驗動物本身、兔血制備過程、操作人員的熟練程度等)影響。在該研究生物活性檢測方法中，由于兔血的差異可能造成實驗結果的誤差，建議采用頸動脈采血，并多只兔血重復實驗或混合兔血后離心使用實驗3次，減少由此帶來的實驗誤差。對照品三七總皂苷建議選擇中檢院供含量測定用的。該研究以三七總皂苷為對照品，建立血塞通注射液APTT生物活性測定方法；符合實驗動物福利，所得數據穩定，重復性好，且與含量測定指標檢測結果一致。建議本品新增生物活性檢測方法結合理化分析嚴格控制產品質量：本品依血凝儀APTT生物活性測定法[2]測定，本法的可信限率(FL%)不得大于10%，三七總皂苷在標示量的70%～98%。

此外，三七總皂苷具有穩定、易得、價格比較便宜等優點，建議以三七總皂苷為對照品，考察活血化瘀類中藥相關生物活性測定方法，以期找到一種適合我國國情、操作簡單、成本較低的方法來控制中藥產品質量。