類葉升麻苷延緩SAMP8小鼠衰老過程及改善免疫功能的作用

陳嘉媛，高 莉，譚 雪，王冬青，閆 明

(1. 石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832003， 2. 新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830011)

阿爾茨海默病(alzheimer′s disease，AD)在臨床主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性認(rèn)知衰退及癡呆，其病理特點(diǎn)是淀粉樣斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)，神經(jīng)元細(xì)胞丟失，膠質(zhì)細(xì)胞的顯著激活，以及全身免疫反應(yīng)。AD全身免疫反應(yīng)的改變包括淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分布和激活的變化、自身抗體的存在或異常細(xì)胞因子的產(chǎn)生[1]。病理學(xué)、遺傳學(xué)和流行病學(xué)研究均支持免疫機(jī)制參與AD發(fā)病機(jī)制的觀點(diǎn)[2]。另外，先天免疫細(xì)胞，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)AD神經(jīng)炎癥的能力，也被認(rèn)為是疾病發(fā)病的重要因素[3-4]。

類葉升麻苷(acteoside，AE)是苯乙醇苷類中一種天然活性成分，具有抗氧化損傷、神經(jīng)保護(hù)、肝臟保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等多種作用。前期研究顯示，類葉升麻苷有改善AD小鼠老化和抑制免疫器官萎縮的作用[5-6]，但其對于免疫功能方面的作用機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在深入研究類葉升麻苷對小鼠老化及免疫細(xì)胞和免疫炎癥因子的影響，探討其對老齡小鼠免疫功能的影響。

1 材料及方法

1.1 藥物與試劑類葉升麻苷(為新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所自制，純度≥98%，20170827 ),鹽酸美金剛片(丹麥靈北藥廠，694478)，75%消毒酒精(新疆愛迪爾生物科技有限公司，20171225)，0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，L217010304),FITC偶聯(lián)小鼠CD4抗體、APC偶聯(lián)抗小鼠的抗原CD3e抗體、PE-CY7偶聯(lián)小鼠CD8抗體、Mouse Th1/Th2/Th17 CBA Kit(BD BIOSCIENCES PHARMINGEN，7276920、7150784、7215735、7076519)

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器SQP電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，北京)，恒溫生化培養(yǎng)箱(博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，上海)，LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌鍋(申安醫(yī)療器械廠，上海)，Allegra 64R 離心機(jī)(Beckman)，F(xiàn)C500流式細(xì)胞儀(Beckman)，4 ℃冰箱(海爾股份有限公司，青島)，-20 ℃冰箱(海爾股份有限公司，青島)，-80 ℃冰箱(Thermo)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)鼠使用健康SAMP8小鼠，以同月齡SAMR1小鼠為對照，♂，體質(zhì)量(20±2)g。購于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(合格證號SCXK(津)2015-0003)。飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所SPF級動物房(動物使用許可證號2018-0001)，溫度(21～25) ℃，濕度24%～52%，12 h明暗交替飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.4 分組及給藥根據(jù)體質(zhì)量及老化評分結(jié)果篩選出12只對照SAMR1小鼠和60只符合要求的SAMP8鼠，SAMP8隨機(jī)分為5組，每組12只，每天灌胃給藥1次，連續(xù)90 d，給藥劑量如下：(1)正常對照組：(SAMR1小鼠)，0.1 mL·10 g-1· d-1生理鹽水灌胃。(2)模型組：0.1 mL·10 g-1· d-1生理鹽水灌胃。(3)美金剛組：10 mg·kg-1· d-1灌胃。(4)類葉升麻苷-低：30mg·kg-1· d-1灌胃。(5)類葉升麻苷-中：60 mg·kg-1· d-1灌胃。(6)類葉升麻苷-高：120 mg·kg-1· d-1灌胃。

1.5 老化評分本研究評定SAM-P 和SAM-R 小鼠的衰老等級方法，參照日本京都大學(xué)著名的竹田俊男和細(xì)川昌則教授制定的小鼠老化度評分標(biāo)準(zhǔn)[7]，根據(jù)老鼠的行為和外觀，觀察了11種評分項(xiàng)的發(fā)生情況，包括：反應(yīng)性、被動性逃避反應(yīng)、皮膚光澤、皮膚粗糙度、皮膚潰瘍、眼部損傷、角膜潰瘍，渾濁、白內(nèi)障和脊柱后凸等。每項(xiàng)指標(biāo)劃分成3～5 級， 根據(jù)統(tǒng)一的評分標(biāo)準(zhǔn)評分，老化度越高體現(xiàn)在獲得的積分更多。

1.6 免疫細(xì)胞檢測在 3 μL CD3、CD4和CD8中分別加入抗凝全血100 μL，充分震蕩混勻，于室溫避光反應(yīng)15 min。取裂紅素2 mL加入并混勻后，再次避光反應(yīng)15 min。反應(yīng)后離心5 min，轉(zhuǎn)速1 000 r·min-1，棄上清。1 mL PBS，1 000 r·min-1離心5 min。200 μL PBS重懸，200目過濾。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，Kaluza Analysis分析處理。

1.7 免疫因子檢測標(biāo)準(zhǔn)品制備：取2 mL Assay Diluent 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，在避免劇烈渦旋下保證混勻，混勻后靜置15 min，再用Assay Diluent倍比稀釋最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品，取每種捕獲微球懸液混合，取標(biāo)準(zhǔn)品或樣品每管50 μL，再依次加入50 μL捕獲微球混合液及50 μL PE檢測抗體孵育，孵育后以1 mL 洗滌緩沖液洗滌、離心，棄上清。為重懸微球每管加入300 μL 洗滌緩沖液,并過200目篩。上機(jī)獲取樣品，使用FCAP軟件導(dǎo)出和分析FCS數(shù)據(jù)文件。

2 結(jié)果

2.1 類葉升麻苷對老化評分的影響本實(shí)驗(yàn)中老化評分分別于給藥前，給藥后45 d、90 d進(jìn)行。給藥前，與對照組相比，SAMP8小鼠老化評分顯著增高；給藥45 d，與對照組相比，模型組老化評分顯著增高，與模型組比，美金剛組及類葉升麻苷中、高劑量組小鼠老化評分顯著降低；給藥90 d，與對照組比，模型組老化評分高于正常組，且有顯著性差異，與模型組相比，美金剛組及類葉升麻苷低、中、高劑量組小鼠老化評分存在顯著降低趨勢(見Fig 1)。

Fig 1 Effect of AE on aging score of SAMP8 mice n=12)**P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs model group

2.2 類葉升麻苷對小鼠免疫細(xì)胞分布的影響如Fig 2如示，與正常組相比，模型組SAMP8小鼠血漿中CD4+/CD8+顯著低于正常組R1鼠，各給藥組血漿中CD4+/CD8+均低于正常組，與模型組相比，美金剛組血漿中CD4+/CD8+顯著增高；與正常組相比，模型組SAMP8小鼠脾臟中CD4+/CD8+顯著低于正常組R1鼠，類葉升麻苷低、中劑量組小鼠脾臟中CD4+/CD8+也顯著低于正常組，類葉升麻苷高劑量組則顯著高于正常組及模型組。

Fig 2 Effect of AE on T cell subsets in peripheral blood and spleen of SAMP8 model n=12)*P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs model group

2.3 類葉升麻苷對小鼠免疫細(xì)胞因子的影響流式細(xì)胞儀檢測各組小鼠血漿及脾臟中Th1型IFN-γ及Th2型IL-4免疫因子表達(dá)差異，結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組小鼠血漿及脾臟中IFN-γ的表達(dá)水平均顯著性降低；與模型組相比，類葉升麻苷低、高劑量組小鼠脾臟中IFN-γ的表達(dá)水平變化明顯，低劑量升高而高劑量降低。模型組小鼠血漿中IFN-γ、IL-4均顯著性降低，與模型組相比，類葉升麻苷低、高劑量組小鼠血漿中IL-4降低，有顯著性差異，類葉升麻苷高劑量組小鼠脾臟IFN-γ、IL-4降低，表現(xiàn)出顯著性差異；與正常組相比，模型組小鼠脾臟Th1/Th2的偏移顯著性降低，與模型組相比，類葉升麻苷低劑量組在脾臟中Th1/Th2升高，表現(xiàn)出顯著性差異。見Fig 3,4。

Tab 1 Effect of Cimicifugatin on Th1-type factor in plasma and spleen of SAMP8 mice n=12)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3 討論

免疫功能在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到重視。除中樞免疫反應(yīng)外，外周免疫反應(yīng)還包括淋巴細(xì)胞功能與亞群分布的變化[10]。人體存在T細(xì)胞、B細(xì)胞兩種免疫細(xì)胞。其中細(xì)胞免疫由T細(xì)胞負(fù)責(zé)。CD4+是輔助T細(xì)胞的一種標(biāo)記。CD8+則是抑制性T細(xì)胞的一種標(biāo)記。CD4+/CD8+的比值的正常，能保證機(jī)體維持正常的免疫功能狀態(tài)，該值降低是機(jī)體免疫功能下降的重要標(biāo)志[8-9]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SAMP8模型鼠較R1鼠CD4+/CD8+顯著降低，SAMP8模型鼠是散發(fā)性阿爾茨海默病的經(jīng)典動物模型[7]，有研究表明，SAMP8小鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)失衡[11]。說明了SAMP8鼠免疫活性普遍下降。這為研究類葉升麻苷對 SAMP8小鼠機(jī)體免疫功能的影響提供了有力背景。 AE高劑量組能顯著提升脾臟中CD4+/CD8+的比值。提示陽性藥物美金剛則相較模型組各數(shù)值均有顯著的良性變化，類葉升麻苷能夠促進(jìn)SAMP8小鼠體內(nèi)輔助性淋巴細(xì)胞的增加，有效抑制殺傷性淋巴細(xì)胞的增多，從而改善機(jī)體的免疫功能，以達(dá)到阿爾茲海默病的控制與治療作用。

此外，已有大量文獻(xiàn)證明細(xì)胞因子在AD的促炎和抗炎過程以及復(fù)雜的認(rèn)知過程中起著關(guān)鍵作用[12]。機(jī)體維持正常的內(nèi)環(huán)境有賴于細(xì)胞因子的動態(tài)平衡狀態(tài)，其狀態(tài)平衡又有賴于Th1、Th2型細(xì)胞特征因子間的相互作用和抑制，若Th1型和Th2型細(xì)胞因子失衡，機(jī)體就會處于失衡的漂移狀態(tài)。Th1/Th2型偏移中Th2型細(xì)胞因子分泌較多，提示了機(jī)體免疫功能的下降，細(xì)胞因子的這種不平衡狀態(tài)與認(rèn)知能力下降和癡呆癥有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)研究中，細(xì)胞因子的分泌是SAMP8小鼠認(rèn)知障礙的潛在機(jī)制之一，許多研究報(bào)告稱，衰老導(dǎo)致Th1和Th2細(xì)胞數(shù)量變化，Th1/Th2值失去穩(wěn)態(tài)平衡[13-14]， IFN-γ和IL-4作為Th1、Th2的特征細(xì)胞因子，二者之間相互拮抗又相互促進(jìn)。

Fig 3 Representative flow cytometry of CD3+ CD4+ T cell expression in peripheral blood of each group n=12)*P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs model group

Fig 4 Representative flow cytometry of CD3+ CD4+ T cell expression in spleen of each group n=12)*P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs model group

Fig 5 Effect of AE on Th1/Th2 change of *P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs model group

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，與正常組相比，在血漿及脾臟中，各組的IFN-γ及IL-4都呈明顯降低趨勢，且模型組中Th1/Th2顯著偏移，提示模型鼠免疫功能的顯著下降，與美金剛組藥物相比，二者在延緩衰老的進(jìn)程中沒有明顯差異，但在Th1/Th2的調(diào)節(jié)及脾臟中免疫細(xì)胞的分布上，類葉升麻苷表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，AE低、中劑量組能夠上調(diào)免疫應(yīng)答模式恢復(fù)Th2/Th1的平衡穩(wěn)態(tài)，使細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)，達(dá)到延緩動物機(jī)體衰老的作用。提示類葉升麻苷的作用機(jī)制可能與免疫平衡相關(guān)。同時(shí)，類葉升麻苷恢復(fù)細(xì)胞因子動態(tài)平衡穩(wěn)態(tài)作用以脾臟表現(xiàn)更為顯著，這與本實(shí)驗(yàn)中類葉升麻苷調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分布以及對模型小鼠老化程度的改善作用均一致，進(jìn)一步表明了類葉升麻苷能夠延緩快速老化小鼠老化進(jìn)程，可能的作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞及免疫因子的動態(tài)平衡、改善機(jī)體的免疫功能。這為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了一定依據(jù)，類葉升麻苷明確的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的深入研究。