JAK2信號通路介導人惡性黑素瘤A375細胞的自噬和凋亡機制研究

[摘要]目的：探討JAK2/STAT3信號通路介導人惡性黑素瘤A375細胞的自噬和凋亡活性，為黑素瘤的發生機制和潛在干預靶點提供理論依據。方法：人惡性黑素瘤A375細胞經復蘇和傳代后隨機分為對照組和JAK2抑制劑干預組，比較兩組細胞培養12h、24h、48h和72h的增殖率（采用MTT定量法）及凋亡率（采用流式細胞術），培養72h的細胞JAK2、p-JAK2、STAT3、LC3B和p-STAT3蛋白相對表達量（采用Western blot法），檢測IL-6和TNF-α水平（采用ELISA法），檢測Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相對表達量[采用反轉錄PCR（RT-PCR）法]。結果：兩組培養12h、24h、48h和72h的細胞增殖率比較，干預組各時間點均明顯小于對照組，而凋亡率明顯大于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。干預組培養72h的細胞p-JAK2和p-STAT3蛋白相對表達量、IL-6和TNF-α水平明顯低于對照組，但LC3B蛋白、Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：JAK2/STAT3信號通路異常激活可能是人黑素瘤A375細胞惡性增殖的重要通路之一，靶向干預JAK2/STAT3信號通路可以促進細胞自噬和凋亡活性上調，有望成為臨床干預的重要靶點。

[關鍵詞]JAK2/STAT3信號通路;黑素瘤;自噬;凋亡;增殖

[中圖分類號]R739.5? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）04-0098-04

Abstract： Objective? To study the autophagy and apoptotic activity of human malignant melanoma A375 cells via by JAK2/STAT3 signaling pathway，and provide theoretical basis for pathogenesis of melanoma and potential intervention target. Methods? After recovery and generation，human malignant melanoma A375 cells were randomly divided into the control group and the JAK2 inhibitor intervention group. MTT and flow cytometry were used to detect proliferation and apoptosis rates of cells after cultured for 12， 24， 48 and 72 hours， Western blot was used to detect relative expressions of JAK2， p-JAK2， STAT3， LC3B and p-STAT3 proteins， ELISA was used to detect levels of IL-6 and TNF-α and reverse transcription PCR （RT-PCR） was used to detect relative expressions of Caspase-3 and Bax/Bcl-2 mRNAs. Results? The cell proliferation rate of the intervention group was significantly lower than those of the control group at 12h， 24h， 48h and 72h， while the apoptosis rate was significantly higher than those of the control group， the differences were statistically significant（P<0.05）. Whats more， relative expressions of p-JAK2 and p-STAT3 proteins， IL-6 and TNF-α levels after 72h in the intervention group were both significantly lower than those of the control group， while expressions of LC3B protein， relative expressions of Caspase-3 and Bax/Bcl-2 mRNAs in the intervention group were all significantly higher than those of the control group（P<0.05）. Conclusion? Abnormal activation of JAK2/STAT3 signaling pathway may be one of important pathways for malignant proliferation in human melanoma A375 cells. Targeted intervention of JAK2/STAT3 signaling pathway can promote up-regulations of autophagy and apoptotic activities of cells， which is expected to become an important target for clinical intervention.

Key words： JAK2/STAT3 signaling pathway; melanoma; autophagy; apoptosis; proliferation

黑素瘤是最常見的皮膚和黏膜惡性腫瘤之一，近年來發病率明顯增多，已引起臨床的高度重視，早期以手術切除為主，中晚期以化療和靶向干預為主[1]。黑素瘤的發生與環境變化和基因突變有關，研究發現[2]，細胞惡性增殖、自噬和凋亡活性下降是黑色素瘤發生、侵襲和轉移的重要機制。細胞自噬和凋亡是細胞存活、分化和內環境穩態維持的重要方式，受體內外多個基因和信號通路的共同調控，具有較強的程序控制性[3]。JAK2/STAT3信號通路是真核生物體內參與調控細胞增殖、分化、損傷修復、炎癥反應、氧化應激、細胞因子表達等重要細胞內途徑之一[4]。IL-6和TNF-α是JAK2/STAT3信號通路的重要誘導劑，在多種惡性腫瘤如結直腸癌、黑素瘤、胃癌的發生和發展中發揮重要作用。JAK2/STAT3信號通路的活化既需要炎癥因子IL-6和TNF-α的誘導，同時又可加劇炎癥因子的釋放，形成炎癥瀑布樣級聯反應，參與惡性腫瘤的凋亡和自噬過程。并且，腫瘤細胞的惡性增殖、自噬和凋亡活性之間存在密切聯系，增殖活性增強提示腫瘤惡性程度較高，越早發生侵襲和轉移;自噬和凋亡是細胞完成自我更新的兩種方式，兩者間可相互影響。基于此，該研究的主要目的是分析介導JAK2/STAT3信號通路激活參與人惡性黑素瘤A375細胞自噬和凋亡程度，為黑素瘤的發生機制和潛在干預靶點提供理論依據。

1? 資料和方法

1.1 細胞培養：人惡性黑素瘤A375細胞購自上海生工科技有限公司，經常規復蘇、傳代培養，采用DMEM培養基+10%胎牛血清配成完全培養液培養，置于37℃ 5%CO2培養箱中每3d進行半量或全量換液。待細胞融合度達80%，以0.25%胰酶消化，進行1：2比例傳代培養，PBS重懸細胞濃度為1×106/ml進行后續實驗。

1.2 研究方法：實驗分為對照組和JAK2抑制劑干預組，對照組采用人惡性黑素瘤A375細胞正常培養，干預組采用JAK2抑制劑AG-490 3ml與A375細胞聯合培養。比較兩組細胞培養12h、24h、48h和72h的增殖率及凋亡率，培養72h的細胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白相對表達量采用Western blot法，ELISA法檢測IL-6和TNF-α水平，免疫熒光標記法檢測微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）陽性率，反轉錄PCR（RT-PCR）法檢測Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相對表達量。

1.3 檢測方法

1.3.1 MTT法檢測細胞增殖率：將各組細胞接種于96孔板中，細胞濃度調整為5×103個/孔，分別培養12h、24h、48h和72h，每個時間點設置3個復孔，結果取平均值作為最終結果。每孔加入40μl MTT溶液（美國Sigma公司）于37℃ 5%CO2飽和濕度培養箱中培養4h，棄上清，然后加入150μl DMSO溶液（美國Sigma公司）搖動10min，置于酶標儀（美國Bio-Rad公司）上檢測490nm波長的吸光度（OD值），以630nm為參考波長。

1.3.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率：將兩組黑素瘤細胞和培養液根據分組要求進行培養，分別于12h、24h、48h和72h收集細胞反應液并進行離心、PBS液沖洗，然后加入熒光標記的共軛膜聯蛋白及碘化丙啶（美國Sigma公司），流式細胞儀（美國BD公司）檢測細胞凋亡率。凋亡試劑盒由美國R&D公司提供。

1.3.3 Western blot法檢測JAK2/STAT3、LC3B蛋白：兩組黑色素瘤細胞和不同培養液共培養72h，然后離心、PBS液沖洗，超聲碎解細胞后根據BCA蛋白定量試劑盒（美國Sigma公司）提示提取細胞總蛋白，并進行濃度和純度測定;去除培養基，PBS洗滌細胞，裂解液裂解細胞，冰浴30min，40℃ 1 500r/min離心5min，吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10μl待測。配膠，上樣，電泳，轉膜，切膜，封閉液封閉1h，逐次兔抗人JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、微管相關蛋白1輕鏈3B（LC3B，含LC3Ⅱ、LC3Ⅰ雙條帶）和內參β-actin一抗（1：2 000，美國sigma公司）、羊抗兔對應二抗（1：500，美國sigma公司）。PBS洗滌、ECL顯色、凝膠成像軟件行半定量分析，結果以目標蛋白與內參的條帶灰度比值表示。

1.3.4 ELISA法檢測IL-6和TNF-α：收集兩組培養72h的細胞，3 000r/min離心15～20min，應用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定IL-6及TNF-α水平。試劑盒由美國DSL公司提供，嚴格按說明書步驟進行。

1.3.5 RT-PCR法檢測Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNAs：利用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，測定RNA濃度，將合格的總RNA轉錄成cDNA，然后進行PCR擴增。上海生工有限公司根據Gene Bank序列合成目標引物序列（見表1），配置反應體系包括cDNA 2μl+上下引物各3μl+Taq聚合酶0.5μl，加入無菌反應水至總體積25μl，參照PCR擴增參數要求設置為95℃ 5min預擴增，（95℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 60s）共30個循環擴增，72℃ 10min結束擴增。收集電泳產物并進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在凝膠成像分析系統中進行半定量分析，結果以目標引物與內參引物的條帶灰度比值表示。

1.4 統計學分析：采用SPSS 20.0統計軟件對計量資料作t檢驗，不同培養時間的細胞增殖率和凋亡率采用重復測量方差分析;P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 兩組細胞增殖率比較：干預組培養12h、24h、48h和72h的細胞增殖率（26.4±8.2，31.5±7.9，58.9±10.5，70.8±12.7）%均明顯小于對照組（30.8±6.7，49.9±11.4，72.4±14.7，92.5±13.7）%，差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 兩組細胞凋亡率比較：干預組培養12h、24h、48h和72h的細胞凋亡率明顯大于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 兩組JAK2/STAT3蛋白相對表達量比較：干預組培養72h的細胞p-JAK2和p-STAT3蛋白相對表達量明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）; 但兩組JAK2和STAT3蛋白相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.4 兩組細胞IL-6和TNF-α表達水平比較：對照組培養72h的細胞IL-6和TNF-α表達水平明顯高于干預組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.5 兩組細胞LC3B蛋白表達情況：干預組培養72h的細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

2.6 兩組細胞Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNAs相對表達量比較：干預組培養72h的細胞Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNAs相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

3? 討論

惡性黑素瘤是一種由黑素細胞演變而來的高度惡性腫瘤，細胞自噬和凋亡活性下降是參與黑色素瘤惡性生物學行為表達的重要機制之一。細胞自噬和凋亡是真核生物體內細胞存活、分化和維持內環境穩態的重要方式，受體內外多個基因和信號通路的共同調控，具有較強的程序控制性。目前，JAK2/STAT3信號通路已證實在免疫反應和腫瘤的發生機制中發揮十分重要的作用[5]。生理狀態下，JAK2/STAT3大多數處于非磷酸化水平，當機體受外界刺激時可發生瞬時、快速的磷酸化轉化，持續時間較短，約6～12h，然后快速消失[6]。JAK2/STAT3通路通過胞內段的酪氨酸蛋白激酶結合位點，與相應受體如IL-6、TNF-α等結合，激活下游各種靶蛋白的酪氨酸殘基，發揮相應的生物學效應[7]。IL-6和TNF-α是JAK2/STAT3信號通路的重要誘導劑，在多種惡性腫瘤如結直腸癌、黑素瘤、胃癌的發生和發展中發揮重要作用[8-9]。

本實驗結果提示，JAK2抑制劑干預人惡性黑素瘤A375細胞后，各培養時間點的細胞增殖率較對照組明顯下降，而凋亡率則明顯升高，提示JAK2/STAT3信號通路是參與黑色素瘤惡性增殖的重要途經之一，而JAK2是靶向干預該信號通路的重要節點[10]。STAT是JAK激酶的重要底物，STAT活化后通過多聚體結合形式存在并穿過核膜與特異性DNA反應元件結合，啟動下游目的基因的轉錄，促使細胞外信號向細胞內轉導，最終發揮調控細胞增殖、分化、凋亡以及免疫調節等功能[11]。研究證實，STAT3具有雙向調節功能，在不同的惡性腫瘤中可能發揮不同甚至相關的激活效應，在黑素瘤細胞中通過阻斷JAK2/STAT3通路可明顯降低p-JAK2和p-STAT3蛋白的相對表達量，而對總蛋白JAK2和STAT3影響較小。提示磷酸化狀態的JAK2/STAT3對影響黑色素瘤的惡性增殖活性具有更加重要的作用[12-13]。

JAK2/STAT3信號通路的活化既需要炎癥因子IL-6和TNF-α的誘導，同時又可加劇炎癥因子的釋放，形成炎癥瀑布樣級聯反應，參與惡性腫瘤的凋亡和自噬過程[14]。本研究結果提示，對照組培養72h的細胞IL-6和TNF-α水平高于干預組，干預組LC3B蛋白、Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯高于對照組。關于細胞自噬機制和活性分子研究最多的是LC3蛋白、Atgl2與Atg5復合體等形成，其中LC3Ⅰ和LC3Ⅱ主要參與自噬體的形成，LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3Ⅱ，主要定位于自噬體膜上，其含量與自噬體數目成正相關[15-16]。自噬和凋亡是細胞完成自我更新的兩種方式，兩者間可相互影響。細胞凋亡是一種精密調節的程序化細胞死亡過程，研究發現細胞內存在多條調控細胞凋亡的信號通路，如線粒體依賴或非線粒體依賴途徑，Caspase家族是決定細胞凋亡方向和活性的最終通路[17-18]。凋亡的實現是通過一系列蛋白酶級聯式激活和切割的過程，其中Caspase-3被稱為死亡蛋白酶，主要發揮對蛋白激酶、核酸酶及細胞骨架的裂解，產生核皺縮、DNA片段等，最終控制凋亡的發生和發展[19]。Bax/Bcl-2比值可影響細胞的凋亡方向和程度，當抗凋亡分子Bcl-2/促凋亡分子Bax≥50%時，細胞表現明顯的抗凋亡效應[20]。

綜上所述，JAK2/STAT3信號通路異常激活可能是人黑素瘤A375細胞惡性增殖的重要通路之一，靶向干預JAK2/STAT3信號通路可以促進細胞自噬和凋亡活性上調，有望成為臨床干預的重要靶點。

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[收稿日期]2019-11-28

本文引用格式：余揚.JAK2信號通路介導人惡性黑素瘤A375細胞的自噬和凋亡機制研究[J].中國美容醫學，2020，29（4）：98-101.