脂蛋白脂酶及比較識別基因-58在子癇前期胎盤中的表達及其相關性

王淼　趙芳菲　劉春梅　陳燕

摘要 目的：通過檢測胎盤中脂蛋白脂酶（LPL）與比較識別基因-58（CGI-58）的表達，探討LPL、CGI-58與子癇前期的關系及其兩項指標的相關性。方法：選取2018年9月至2019年7月在我院分娩的子癇前期患者36例為病例組，以同期分娩的正常孕婦40例為對照組。全自動生化分析儀檢測患者分娩前1周內的血脂水平。運用RT-PCR技術檢測胎盤中LPL、CGI-58mRNA的相對表達量。Western blotting法檢測胎盤中LPL、CGI-58蛋白的表達水平，并分析兩者的相關性。結果：①子癇前期胎盤組織中LPLmRNA的相對表達量低于對照組（t=8.431，P<0.05），CGI-58mRNA的相對表達量較對照組下降（t=6.297，P<0.05）。②LPL蛋白在子癇前期胎盤中的濃度為0.45±0.04，低于對照組的0.74±0.10，差異有統計學意義（t=4.815，P<0.05）。CGI-58蛋白在子癇前期胎盤中濃度為0.63±0.19，低于對照組的0.87±0.12，差異有統計學意義（t=2.837，P<0.05）。③LPL蛋白與CGI-58蛋白的相關表達量呈正相關（r=0.602，P=<0.05）。④子癇前期患者血脂中甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、載脂蛋白B、動脈粥樣硬化指數較對照組升高，高密度脂蛋白膽固醇、載脂蛋白A較對照組降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：子癇前期孕婦LPL及CGI-58表達水平降低，二者之間的表達水平存在相關性。

中圖分類號? R714.244? ? 文獻標識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2020）06-033-04

子癇前期是一種妊娠期特發性疾病，其發病率約為3%-6%，目前仍然是全球孕產婦及胎兒發病率和死亡率的主要原因[1]。子癇前期在發展中國家的發病率約為發達國家的7倍，給我國醫療衛生帶來巨大挑戰[2]。目前認為子癇前期是一種多因素、多機制及多通路致病的疾病，其中胎盤病變被認為是其發病的中心環節。甘油三酯脂肪酶基因家族中的脂蛋白脂酶（1ipoprotein lipase，LPL）及比較識別基因-58（CGI-58）通過脂質水解作用，在血漿及胎盤中轉運脂蛋白及游離脂肪酸，對維持正常脂質代謝十分重要。本研究通過檢測LPL和CGI-58在子癇前期產婦胎盤組織中的表達，探討LPL、CGI-58在血脂代謝異常及子癇前期發病中的可能作用。

1對象與方法

1.1研究對象 選擇2018年9月至2019年7月在華北理工大學附屬醫院住院分娩的子癇前期孕婦37例為病例組，以同期無妊娠并發癥和合并癥的健康孕婦40例為對照組。所有孕婦的孕周均在37～41周，單胎剖宮產分娩，無煙酒、吸毒不良嗜好，排除合并糖尿病、慢性高血壓、心臟病、嚴重肝腎疾病，自身免疫性疾病，其他內分泌疾病、血液性疾病、胎膜早破和近期感染病史。子癇前期的診斷標準依據謝幸主編的《婦產科學》第9版。

1.2標本采集 入院后采集次日空腹肘靜脈血3mL，離心后檢測血清中的血脂濃度。在胎盤娩出30分鐘以內，嚴格無菌條件下，于胎盤母體面處隨機取1份組織，大小約1×1×1cm，注意避開栓塞及鈣化部位。將胎盤組織放入滅菌的凍存管中，于液氮中保存，用于RT-PCR及Western blotting檢測。

1.3主要試劑 兔抗人LPL單克隆抗體購自美國Affinity Biosciences公司;兔抗人CGI-58單克隆抗體購自武漢ABclonal公司;內參β-actin購自美國proteintech公司;蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術公司。

1.4檢測方法

1.4.1血脂濃度檢測

由專業檢驗員采用邁瑞420型全自動生化分析儀完成。檢測項目包括甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、載脂蛋白A（ApoA）、載脂蛋白B（ApoB）濃度。

1.4.2 RT-PCR法檢測胎盤組織LPLmRNA和CGI-58mRNA表達

從-80℃液氮罐中取出胎盤組織，稱重后置于液氮預冷的研缽中進行研磨，并不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀，加入Trizol裂解液后提取總RNA，用紫外分光光度計測量樣品純度及濃度。按照試劑盒說明書將RNA轉錄為cDNA，并以此為模板進行PCR擴增。以肌動蛋白（β-actin）為內參照，引物序列：For：5′-ATATGAGATGCGTTGTTA-3′，Rev：5′-AAGTATTAAGGCGAAGAT-3′。LPL基因引物序列：For：5′-CATAGCCTATAATTGGTTAG-3′，Rev：5′-GTGTAGATGAGTCTGATT-3′。CGI-58基因引物序列：For：5′-ATCAAGGGTTAATCATCTCA-3′，Rev：5′-CTGGAATTGGTCTGTCTT-3′。PCR反應過程：95℃10min，95℃15s，60℃20s×40循環，72℃30s，60℃1min。采用2-ΔΔCT法計算兩組中CGI-58mRNA、LPLmRNA的相對表達量，以β-actin為內參，ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值，ΔΔCt=病例組ΔCt值-對照組ΔCt值，設對照組2-ΔΔCT值為1，計算病例組mRNA的相對表達量。

1.4.3 Western blotting法檢測胎盤組織LPL和CGI-58蛋白的表達

將50mg胎盤組織在液氮中研磨至粉末狀，與RIPA蛋白裂解液混勻，冰盒中保存30min，4℃，2000g的條件下離心15min，收集溶解組織蛋白的上清液用于Western blotting檢測。用Bradford法測定蛋白濃度。上樣15μg蛋白樣品，10%聚丙烯酰胺凝膠行SDS-PAGE電泳，用聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride PVDF）分離蛋白。在PVDF膜上加入兔抗人LPL單克隆抗體（1∶1000）/兔抗人CGI-58單克隆抗體（1∶1000），4℃過夜，TBST緩沖液洗膜3次。加入羊抗兔IgG二抗（1∶3000），室溫孵育2h，TBST緩沖液洗膜3次。滴加ECL化學顯色劑，在暗室進行曝光顯影。檢測各條帶的光密度值，計算目的蛋白與內參蛋白的比值，作為目的蛋白的相對表達量。

1.5統計學分析

運用SPSS17.0軟件包進行統計分析，正態分布的計量資料以“均數±標準差”的形式表示，兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，兩個變量之間的相關性采用直線相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組孕產婦血脂濃度的比較

病例組患者血清中的的TG濃度、LDL-C、ApoB較對照組升高，HDL-C、ApoA濃度較對照組降低，差異有統計學意義（P<0.01）。兩組之間TC濃度及脂蛋白a（Lp（a））水平差異無統計學意義（P >0.05）。動脈粥樣硬化指數[AI=（TC-HDL-C）/HDL-C]可直接反應脂代謝紊亂程度，是預測動脈粥樣硬化的一種指標，病例組AI指數高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2兩組孕產婦胎盤組織中LPLmRNA和CGI-58mRNA表達的比較

病例組胎盤組織中LPLmRNA相對表達量，CGI-58mRNA的相對表達量均低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3兩組孕產婦胎盤組織中LPL和CGI-58蛋白的表達

Western blotting印跡結果顯示，LPL蛋白及CGI-58蛋白在病例組胎盤中的濃度均低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。LPL蛋白與CGI-58蛋白的相關表達量呈正相關（r=0.602， P<0.05）。

3.1母體血脂水平與子癇前期

子癇前期發病與脂代謝異常有關，患者的血脂水平可出現動脈粥樣硬化樣改變[3-4]。本研究中發現，TG、LDL-C及ApoB具有血管損傷作用，其濃度在子癇前期中升高，血管保護性HDL-C及ApoA濃度較對照組降低，AI可反映動脈粥樣硬化的程度，是危險因素與保護因素的比值，在子癇前期中比值升高。 Wojcik-Baszk等人研究表明子癇前期孕婦血脂中總膽固醇濃度>205mg/dL、TG濃度>133mg/dL，分別較正常孕婦升高4.16倍、3.6倍，LDL濃度升高10.4%，HDL濃度降低7%，與本研究一致。子癇前期中存在脂質代謝紊亂，可產生大量過氧化物，釋放活性氧物質引起氧化應激反應，進一步造成血管舒張功能減低及內皮損傷，與子癇前期發病有關。

TG濃度升高是子癇前期的重要標志，Wojcik-Baszko等人發現子癇前期患者的TG濃度較正常孕婦升高幅度更大，高甘油三脂血癥可使子癇前期發病風險升高4倍[5]。目前認為LDL主要以氧化修飾低密度脂蛋白（OX-LDL）的形式參與動脈粥樣硬化性心腦血管疾病的發病環節，高OX-LDL可使子癇前期的發病風險增加了1.7倍[6]。OX-LDL可產生大量活性氧，引起氧化應激，使泡沫細胞在血管內皮聚集，同時抑制內皮細胞和血小板合成前列環素，促進血栓素的形成，引起血管收縮及內皮損傷[7]。HDL參與脂質代謝過程，使血清CM、VLDL濃度降低，阻礙膽固醇在血管壁和其他組織中的聚集，有助于清除脂質，對血管起到保護作用[8]。在子癇前期中，低水平的HDL-2-C和高水平的TG影響血管功能，使前列環素/血栓素比例下降，使血管緊張素-2的敏感性增加，血壓增高，導致一系列病理變化[9]。高膽固醇血脂，與子癇前期血脂無明顯相關性，雖在FH雜合子女性未見早產或低出生體重高風險，且FH病例中子癇前期、子癇或妊娠期高血壓的患病率無顯著增高，但FH純合子女性的妊娠大多是致命性的，且急性冠狀動脈事件發生率較高[10]。載脂蛋白是血漿脂蛋白中的蛋白質部分，能夠結合和運輸血脂到機體各組織進行代謝及利用。ApoE促進子癇過脂代謝異常前期發生的機制尚不明確，可能通過脂代謝異常和炎癥、凋亡反應，并與一氧化氮合酶共同作用影響子癇前期發病[11]。

所以我們推測參與脂質代謝的關鍵性物質可能在子癇前期的發病中起一定作用

3.2 LPL、CGI-58在子癇前期胎盤中的表達及意義

胎盤脂質轉運是胎兒重要的供能方式，母體TG必須通過胎盤TG分解為游離脂肪酸進入胎盤，胎兒體內20%-50%的脂肪酸來自母體循環[12]。LPL是TG脂肪酶家族成員之一，主要的生理功能是水解乳糜微粒（CM）和極低密度脂蛋白（VLDL）顆粒內的TG，使之轉變為小分子脂肪酸、載脂蛋白和磷脂，提供組織氧化及供能[13]。CGI-58主要表達在脂肪細胞的脂滴中，可作為激動蛋白參與TG脂肪酶的水解過程，使其催化效率提升20倍[14]。CGI-58與LPL共同參與TG的水解過程，其表達異常可造成胎盤脂質轉運障礙，造成脂質過氧化物堆積，引起血管內皮損傷，影響胎盤的脂質代謝及能量供應。

子癇前期孕婦血脂、脂蛋白代謝存在明顯異常。胎盤組織化學研究表明子癇前期時胎盤梗死，胎盤中LPL酶活性明顯下降，導致營養物質轉換能力下降，影響胎兒生長發育。張春利等利用RT-PCR方法發現子癇前期組LPLmRNA表達水平顯著低于正常組，認為子癇前期胎盤合成LPL的功能降低，促使血TG水平升高，導致或加重了血管內皮損傷，LDL廓清率下降，促使動脈粥樣硬化發生，子癇前期形成或加重[15]。Aung等[16]發現，富含TG的脂蛋白引起脂解產物累積時，可激活激活轉錄因子3（activated transcriptional factor3，ATF3），并與下游炎癥分子結合（IL-1、IL-8、E選擇素、VEGF等），繼而促發內皮細胞炎癥與凋亡。一項針對子癇前期基因變異的Meta分析發現，LPLrs268的G等位基因與LPL活性降低和血脂異常有關，由于血脂異常可導致內皮細胞功能障礙，G等位基因攜帶者可能增加發生子癇前期的風險。LPL等位基因攜帶者患冠心病的風險增加，LPL的rs268變異與不良脂質分布相關。遺傳變異的存在可能導致有先兆子癇病史的婦女患心血管疾病的風險增加[17]。本研究中子癇前期胎盤組織CGI-58、LPL表達下降（P<0.05），推測胎盤組織低表達CGI-58、LPL不僅影響全身脂質代謝水平，還與母胎界面的營養輸送有關，低表達CGI-58、LPL可能影響胎盤淺著床、胎盤血管化，最終導致滋養層細胞浸潤不足導致子癇前期發生。

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[2020-03-26收稿]