水產品特定腐敗菌應用價值及分析技術研究進展

左迪 馬長安 李博

摘 要：特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）是影響水產品腐敗的主要因素之一。本文分析SSO在水產品貨架期預測與延長中的實際應用價值，總結水產品SSO多種分析技術，如細菌基因組重復序列聚合酶鏈式反應、變性梯度凝膠電泳、限制性片段長度多態性和高通量測序等，為水產品SSO分析技術的研發提供理論參考，也為水產品SSO的深入研究提供理論依據。

關鍵詞：水產品;特定腐敗菌;貨架期預測;應用價值;分析技術

A Review of Specific Spoilage Organisms in Aquatic Products： Application Value and Analytical Technologies

ZUO Di， MA Changan， LI Bo*

（School of Health and Social Care， Shanghai Urban Construction Vocational College， Shanghai 201415， China）

Abstract： The specific spoilage organism （SSO） is one of the most important causes of aquatic product spoilage. Here， we review the potential value of SSO in predicting and more broadly extending the shelf life of aquatic products and we summarize various technologies for the analysis of SSO in aquatic products such as repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction （Rep-PCR）， denaturing gradient gel electrophoresis technology （DGGE）， restriction fragment length polymorphism technology （RFLP） and high-throughput sequencing. We hope that this review will provide a theoretical basis for the development of new technologies to analyze SSO in aquatic products for further research.

Keywords： aquatic products; specific spoilage organisms; shelf life prediction; application value; analytical technologies

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201005-240

中圖分類號：TS254.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）12-0094-05

引文格式：

左迪， 馬長安， 李博. 水產品特定腐敗菌應用價值及分析技術研究進展[J]. 肉類研究， 2020， 34（12）： 94-98. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201005-240.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZUO Di， MA Changan， LI Bo. A review of specific spoilage organisms in aquatic products： application value and analytical technologies[J]. Meat Research， 2020， 34（12）： 94-98. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201005-240.? ? http：//www.rlyj.net.cn

每年，全世界因微生物污染而造成的食物腐敗率高達25%，腐敗微生物的研究受到學者們的廣泛關注[1]。水產品味道鮮美，營養豐富，是重要的優質動物蛋白源，深受消費者青睞。水產品因肌肉等組織中水分、不飽和脂肪酸和可溶性蛋白的含量很高，在捕撈至加工銷售過程中易發生腐敗變質現象[2]，微生物是引起水產品腐敗變質的主要原因，因此，控制和分析導致水產品腐敗的微生物種類，延長水產品的貨架期具有重要的實際意義和經濟價值[3]。本文綜述水產品的腐敗機理，對引起腐敗的特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）進行分析，同時對SSO的分析方法進行比較，旨在為抑制SSO新技術的開發提供應用參考，也為水產品貯藏和貨架期的延長提供指導。

1 水產品SSO

水產品腐敗主要是指某些微生物在生長、代謝過程中會產生胺、硫化物、醛、酮、酯、有機酸等物質，同時伴有不良氣體和滋味，使得水產品在感官上不被接受。而在水產品腐敗過程中占有優勢的這些微生物被稱為SSO。SSO在水產品貯藏早期的數量和群落占比都非常小，但隨著貯藏時間延長，SSO的數量快速增長，菌落占比明顯上升。

水產品中的SSO種類眾多，其分布和數量受到水產品的種類、產地、季節、加工及貯藏環境等因素影響。目前，已知的水產品SSO主要有鮮魚中的弧菌科（Vibrionaceac）、假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）;魚、貝和甲殼動物中的希瓦氏菌（Shewanella）、磷發光桿菌（Photobacterium phosphoreum）、乳酸菌（Lactobacillus）、熱殺索絲菌（Brochothothrix thermosphacta）、芽孢桿菌（Bacillus）和梭狀芽孢桿菌（Clostridium prazmowski）[4-7]等。

2 SSO的應用

2.1 SSO生長模型及水產品貨架期預測

細菌菌落總數是評判水產品新鮮度的重要指標，而水產品因貯藏條件的差異而表現出不同的腐敗特性，因此依據細菌菌落總數評判水產品新鮮度并不準確[8]。在水產品貯藏期間，SSO的生長和繁殖速率明顯高于其他細菌，且隨著貯藏時間的延長，SSO在菌落總數中的比例也不斷增加，SSO的代謝產物有明顯的異味及腐臭味，感官刺激強烈，因此SSO的數量或代謝產物的含量可以作為水產品新鮮度的評定指標，同時SSO的數量和生長模型可預測水產品剩余貨架期。歐盟“魚類鮮度評定”研究中，確定了產品剩余貨架期與腐敗希瓦氏菌、磷發光桿菌、熱殺索絲菌、乳酸菌的數量直接相關，且遠大于總活菌數與魚類剩余貨架期的相關性[9]。因此，建立腐敗希瓦氏菌、磷發光桿菌和假單胞菌屬的生長動態模型，并應用于有氧、真空、氣調包裝冷鏈水產品剩余貨架期的預測[10-11]。

水產品貨架期與SSO的數量密切相關，建立SSO生長預測模型有助于水產品質量的保證和貨架期的預測。早期的概率模型在水產品加工貯藏中應用廣泛，但概率模型屬于典型的經驗模型，不能明確顯示微生物的實際生長情況，因此早期的概率模型被動態模型取代。根據模型中變量的不同，可分為初級模型、次級模型和三級模型[12]。

初級模型反映在特定條件下微生物隨時間變化而產生的差異，一般包含修正的Gompertz模型、Baranyi模型、Logistic模型、Richards模型、Stannard模型及Schnute模型等，其中修正的Gompertz、Baranyi、Logistic 3 種模型是初級模型中應用較為廣泛的生長預測模型。修正的Gompertz模型能夠繪制生長延滯期、快速生長期等微生物生長發育不同時期的S型曲線，預測效果較好;而Baranyi與Logistic模型最大的區別在于Baranyi模型中添加了遲滯期參數[13];魚類氣調包裝中的SSO磷發光桿菌動力學采用Logistic模型，結果顯示，預測貨架期與實測貨架期相比相對誤差較小[14]。

次級模型反映環境因素，如溫度、pH值、水分活度、氣體組成等對微生物生長的影響，次級模型多涉及響應面方程、平方根方程和Arrhennius方程等，其中響應面方程可以與修正的Gompertz模型聯合使用;Arrhennius方程顯示微生物與溫度的相互關系，但此模型并不適用于冷藏食品[15]。建立不同溫度條件下假單胞菌生長的平方根模型與Arrhenius模型，結果顯示，平方根模型對于微生物最大比生長速率與生長延滯期的預測偏差小于Arrhenius模型[16]。

三級模型也稱之為專家模型，是在初級模型和次級模型基礎上建立的共享軟件，也是能夠計算不同環境下微生物行為的專門系統，Combase數據庫是全球范圍內涉及食品微生物模型的最大數據庫，模擬微生物具體生長環境存在一些局限性，所以專家模型還有待于進一步的研發與完善[17]。

2.2 SSO的抑制及水產品貨架期的延長

SSO是引起水產品腐敗的主要因素，根據SSO的生物學特性抑制SSO的生長，能夠延長水產品的貨架期。常采用低溫貯藏、不同包裝（如空氣包裝、真空包裝、氣調包裝等）、保鮮處理3 種方法抑制SSO生長。

貯藏溫度影響微生物的生長，進而影響水產品的腐敗，因此水產品主要以低溫貯藏為主，低溫貯藏能在一定程度上抑制SSO的生長，延長水產品的貨架期;鱸魚（Lateolabrax japonicus）和草魚（Ctenopharyngodon idellus）在微凍（-2 ℃）狀態下，SSO的生長抑制率明顯高于冷藏（4 ℃）狀態，微凍貯藏還能緩解鱸魚品質的劣變[18];冷藏條件下的氣調包裝羅非魚片，貨架期可延長至18 d[19]。

水產品主要通過袋裝、真空包裝、氣調包裝等形式進行包裝，SSO的種類隨著水產品包裝方式的不同而產生明顯差異，因此可以選用不同的包裝方式抑制SSO的生長。在扇貝的貯藏中，產品處理后采用真空包裝方式，其殘存的SSO（梭狀芽孢桿菌）受到抑制，且產品的水分含量仍保持在較高的水平，在保證水產品安全的基礎上又保證其食用品質[20];地中海旗魚（Tetrapturus）采用有氧托盤包裝，其SSO為假單胞菌和腐敗希瓦氏菌，更換為真空包裝，SSO變為乳酸菌，而變更為氣調包裝后，SSO則為磷發光桿菌，不同包裝方式旗魚的SSO種類明顯不同，其中氣調包裝旗魚貨架期最長，而托盤包裝狀態下，旗魚的腐敗率最高[21]。

水產品中常采用物理保鮮、化學保鮮和生物保鮮等方法控制SSO，延長貨架期。采用殼聚糖溶液（2 g殼聚糖加入98 mL體積分數1%醋酸溶液混合后配制成）和石榴皮提取物（體積比1∶2）處理虹鱒（Oncorhynchus mykiss）后，-18 ℃條件下虹鱒的保藏期長達6 個月[22];混合保鮮劑聚己二酸丁二酯和牛至精油組成的生物薄膜用于魚片貯藏后，可有效減少魚片中嗜冷菌數量[23];生物保鮮劑處理青占魚后，其貨架期延長4～5 d[24];貯藏帶魚（Trichiurus haumela）中添加茶多酚（生物抗氧化劑）和Nisin（生物抗菌劑）后，帶魚貨架期有效延長6 d[25-26]。

3 SSO分析技術的研究現狀

水產品中的SSO與產品種類有關，且存在很大差異。傳統的SSO分析方法包括鏡檢、平板培養、生化反應、產氣實驗等，但這些方法周期較長，靈敏度和準確度較低[27]，且并非所有的食品微生物都可進行培養，因此，傳統的培養鑒定分析水產品SSO的方法存在一定局限性和制約性。隨著分子生物學技術的發展，分子診斷技術多用于SSO分析，其中聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）廣泛應用于食品微生物領域[28]。水產品中SSO的分析技術包括細菌基因組重復序列PCR（repetitive extra-genic palindromic PCR，Rep-PCR）、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和高通量測序技術等。

3.1 Rep-PCR技術

Rep-PCR技術以細菌DNA中重復的回文序列為引物，對細菌基因組進行擴增后得到指紋圖譜，揭示基因組間的差別，在細菌分析和檢測方面具有很好的簡捷性和實用性[29]。DiversiLab（DVL）系統是以Rep-PCR技術為原理的自動化分子分型系統。采用DVL系統對食品中的21 株副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）進行分子分型，分析各菌株之間的相關性，并將分型結果與脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）技術結果相比較，發現DVL系統中副溶血性弧菌分群能力和分辨率與PFGE分型結果相似[30]，但其簡便性和實用性遠高于PFGE技術，同時Rep-PCR法也明顯優于核糖體分型方法[31-32];采用DVL系統和PFGE 2 種方法分別對2 株阪崎腸桿菌屬（Cronocacter）菌株丙二酸鹽克羅諾桿菌（Cronocacter malonatius）和都柏林克羅諾桿菌（Cronocacter dublinensis）進行分型比較，結果表明，Rep-PCR對菌株分類和種群分類的分析效果明顯優于PFGE[33];采用Rep-PCR技術分析150 份水產品中的副溶血性弧菌分離株，發現Rep-PCR分析技術不僅可以區分不同分離株，還可以區分不同病毒型的分離株[34]。

3.2 DGGE技術

DGGE技術是利用DNA結構的特異性和穩定性，結合凝膠電泳測定細菌16S rDNA片段擴增產物，分析不同條件下不同樣品中微生物的群落組成變化和數量變化，判斷樣品中的優勢菌[35]。與其他分析技術相比，DGGE技術在微生物群落多樣性和種群差異性檢測方面具有顯著優勢，近年來DGGE技術也越來越多地應用于水產品SSO的研究[36-37]。大西洋庸鰈（Hippoglossus hippoglossus）比其他大多數白魚物種具有更長的保質期，對其SSO的研究具有重要的實際應用價值，研究結果也能為其他魚類保質期的延長提供參考[38]。采用DGGE技術分析海水網箱養殖青石斑魚（Epinephelus awoara）體表和鰓組織中的黏附菌群，結果表明，青石斑魚體表黏附菌群組成結構較為復雜，無明顯的優勢菌群，而鰓組織中的黏附菌群組成結構較為簡單，存在明顯的優勢菌群，且體表與鰓組織中的黏附菌群結構存在明顯差異，而個體間體表黏附菌群結構相似度較高，DGGE技術能夠直觀分析養殖水體中的微生物多樣性，獲得環境微生物群落中的優勢菌群[39]。

3.3 RFLP技術

RFLP技術的原理是檢測DNA在限制性內切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，PCR技術與RFLP分析技術結合在一起可以得到簡單有效的分子圖譜。核糖體RNA是特定的目的基因，其中以16S rDNA PCR與RFLP技術最為成熟。利用RFLP技術分析冷藏條件下羅非魚下腳料酶解液中的SSO類型，RELP分析顯示，冷藏條件下存在3 種腐敗菌，其中分型Ⅰ有11 種，分型Ⅱ有4 種，分型Ⅲ有3 種，通過序列比對及系統進化樹分析，分型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別與假單胞菌、氣單胞菌、芽孢桿菌16S rDNA相似性極高，表明冷藏條件下羅非魚下腳料酶解液中SSO為假單胞菌[40]。

以鱸魚為研究對象，采用末端限制性片段長度多態性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）

技術分析冷藏條件下鱸魚菌群的變化，推斷假單胞菌屬和環絲菌屬（Pseudomonas sp.）是造成鱸魚貨架期縮短的優勢腐敗菌[41]。RFLP技術能夠簡單、快速確定水產品中的SSO，具有較好的應用前景。

3.4 高通量測序技術

高通量測序技術是DNA測序發展里程碑，主要包括以454（GS-FLX）、Solexa Genome Analyzer和SOLiD為代表的第2代高通量測序技術，以HeliScope TIRM和Pacific Biosciences SMRT為代表的單分子測序技術，以及Life Science公司推出的Ion Personal Genome Machine（PGM）測序技術等[42]。高通量測序技術具有測序精準、產出量高、成本低廉等諸多優點，目前已被廣泛應用于水產品SSO的研究中[43-44]。

利用高通量測序技術分析不同冷藏時間（0、4、8 d）牡蠣中SSO的變化，結果表明，冷藏初期牡蠣中SSO為弧菌屬、希瓦氏菌屬和交替假單胞菌屬，隨著冷藏時間的延長，牡蠣SSO中弧菌屬所占比例迅速下降，SSO為希瓦氏菌屬和交替假單胞菌屬[45]。應用高通量測序方法研究克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）在4 ℃冷藏期間微生物多樣性及SSO種類，結果顯示，希瓦氏菌、肉食桿菌屬（Carnobacterium sp.）、環絲菌屬、嗜冷菌屬（Psychrobacter sp.）、漫游球菌屬（Vagococcus sp.）、

不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）等在腐敗末期時的物種相對豐度為90.57%，確定克氏原螯蝦的優勢腐敗菌為希瓦氏菌、肉食桿菌等[46]。采用高通量測序技術分析蝦夷扇貝柱在不同貯藏溫度（4、15、25 ℃）下SSO的變化，結果顯示，4 ℃貯藏條件下蝦夷扇貝柱中SSO為發光桿菌屬（Photobacterium）、別弧菌屬（Aliivibrio）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas），15 ℃貯藏條件下蝦夷扇貝柱中SSO為發光桿菌屬和別弧菌屬，而25 ℃貯藏條件下蝦夷扇貝柱中SSO為發光桿菌屬、別弧菌屬、梭桿菌屬（Fusobacterium）和乳酸菌屬（Lactobacillus），隨著貯藏溫度的變化，SSO種類和所占比例均有明顯改變[47]，這也為水產品的保鮮和貨架期的延長提供了參考。為揭示超高壓處理對牡蠣腐敗菌群的影響，采用高通量測序技術分析生鮮和腐敗牡蠣的細菌群落結構，結果表明，新鮮牡蠣中SSO以弧菌屬、希瓦氏菌屬和交替假單胞菌屬為主，而腐敗后牡蠣中的SSO以交替假單胞菌屬和希瓦氏菌屬為主，超高壓處理改變了牡蠣冷藏過程中SSO的構成，腐敗希瓦氏菌經400 MPa及以上壓力處理后未檢出活菌[48]。

利用高通量測序技術揭示凡納濱對蝦（4±1） ℃貯藏過程中菌群結構的變化，結果表明，貯藏凡納濱對蝦初始菌群以鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）和寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）為主;隨著冷藏時間的延長，鞘脂桿菌屬、金黃桿菌屬、寡養單胞菌屬的比例迅速降低，系統進化樹分析結果表明，交替假單胞菌屬、希瓦氏菌屬和別弧菌屬成為優勢菌，高通量測序能夠更加全面和準確地顯示凡納濱對蝦中菌群的組成、豐度信息及冷藏條件下的SSO[49];高通量測序能夠對水產品在不同貯藏環境及不同貯藏時間的優勢菌群進行準確分析，同時可以結合微生物動力學等知識，用于貨架期預測模型的構建、延長貨架期等。

4 結 語

SSO的生長是水產品腐敗變質的主要原因，確定SSO在不同貯藏條件下的生長特性，建立SSO生長預測模型，對于了解不同條件下水產品的腐敗特性、延長水產品的貨架期、保證水產品的質量具有重要意義。水產品SSO及貨架期預測模型的開發和優化仍是研究的重點，同時應結合多種分析技術確定SSO，深入探究SSO的腐敗機制，研發出更有效的SSO控制新技術。

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