胃癌中MCU的表達及對胃癌細胞轉移的作用

王瀟飛，程 光，馬艷君，董麗儒，張 爽，宋旭東

隨著癌轉移機制研究的不斷深入，線粒體鈣穩態與惡性腫瘤的發展關系備受重視。線粒體鈣單向轉運蛋白(mitochondrial calcium uniporter, MCU)是鈣流入線粒體、控制細胞能量代謝、產生活性氧和程序性細胞死亡的主要介質[1]。目前研究認為，MCU與腫瘤大小和淋巴浸潤相關，并提示有助于腫瘤生長和轉移的發生；推測MCU通過HIF-1α影響VEGF的表達，抑制MCU的表達顯著降低乳腺癌細胞侵襲和遷移能力[2]。本實驗進一步探討人胃癌組織中MCU表達以及對胃癌細胞侵襲和遷移的影響，為MCU能作為診治的新靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2015～2018年華北理工大學附屬醫院病理科存檔的60例胃癌手術切除標本和20例新鮮胃癌標本，所有病例均由副主任級別以上病理醫師確診。本實驗使用的臨床組織樣本均獲得患者知情同意。

1.2 細胞株 人胃癌細胞株MGC-803購于上海中喬新舟生物公司。

1.3 抗體及試劑 一抗MCU小鼠單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc)、HIF-1α、TGF-β、E-cadherin兔多克隆抗體(Proteintech Inc)、β-actin兔多克隆抗體(北京博奧森公司)；RPMI 1640培養基、青鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA消化液(HyClone公司)；胎牛血清(FUMENG GENE Inc)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)(北京索萊寶公司)，總蛋白提取試劑盒(南京凱基公司)，Transwell小室(Corning Inc)，Alexa Fluor 594標記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋公司)，Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(Invitrogen Inc)，ECL超敏發光液(Thermo Fisher Scientific Company)，Cell counting KIT-8(同仁化學研究所)，Spermine小分子誘導劑(Cayman Chemical company)，Matrigel基質膠(BD)。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養和CCK-8實驗 人胃癌細胞株MGC-803復蘇，37 ℃ 5%CO2完全培養基培養，3天傳1代。在細胞對數生長期時，收集細胞并計數、進行實驗。CCK-8實驗：按照每孔2 000個細胞接種到96孔板，細胞貼壁穩定24 h后，給予不同劑量的Spermine(12.5、25、50、100、200 μmol/mL)，每組復4孔，繼續培養48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續培養3 h，取出用酶標儀測定在450 nm處的吸光度并計算增殖倍數。

1.4.2 siRNA MCU轉染 參照Lip2000轉染試劑盒說明進行操作。Opti-MEMR Ⅰ無血清培養基適量，稀釋Lip2000及MCU siRNA和Control siRNA，將稀釋后的Lip2000與siRNA混勻，其中siRNA轉染的濃度是100 nmol/L，將Lip2000-siRNA形成的復合物于室溫環境中孵育20 min。取生長至對數期的MGC-803細胞胰酶消化后制成單細胞懸液，以每孔8×105個細胞接種于6孔板，RPMI 1640完全培養基(含血清不含抗生素)培養，細胞達50%生長融合度時，棄掉培養液，Lip2000-siRNA形成的復合物加入到細胞培養板中，混合均勻后于培養箱中常規孵育24 h，更換培養基(含血清和抗生素)，繼續培養24 h，收集細胞檢測各組細胞中MCU的蛋白表達。本實驗使用的干擾MCU序列為：hMCU siRNA-2正義鏈5′-GAAUUUGGGAGCUGUUUAUTG-3′；hMCU siRNA-2反義鏈5′-AUAAACAGCUCCCAAAUU CTG-3′。文中以siRNA MCU表示。

1.4.3 免疫組化 免疫組化染色采用SP法。石蠟包埋胃癌組織和癌旁組織切片，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸洗，抗原修復后，一抗4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，二抗37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3次，DAB顯色，復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，400倍光鏡下觀察蛋白表達情況并拍照。應用Image-Pro Plus 6.0圖像處理系統測量各組蛋白的平均光密度。

1.4.4 免疫熒光 新鮮胃癌組織和癌旁組織冷凍切片，經95%乙醇固定，PBS水洗，1%Triton-100，37 ℃孵育15 min，PBS水洗3遍，山羊血清工作液封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，熒光二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS沖洗3次，抗衰減DAPI染核，熒光顯微鏡下，400倍光觀察熒光表達并拍照。應用 Image-Pro Plus 6.0 圖像處理系統測量各組蛋白的平均光密度。

1.4.5 線粒體膜電位 細胞對數增長期，接種六孔板，每孔5×105個，根據實驗分為對照組、Spermine組、siRNA MCU組，干預48 h，PBS洗滌。加入1 mL培養基工作液和1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細胞培養箱中37 ℃孵育20 min。37 ℃孵育結束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次。加入2 mL細胞培養液。熒光顯微鏡下觀察拍照，使用IPP 6.0軟件分析[3]。

1.4.6 Transwell實驗 預先用Matrigel包被Transwell小室，將細胞接種于上室(每室5×105個細胞)，上室用無血清培養液，下室用含血清工作液培養，培養48 h后，4%多聚甲醛固定10 min，棉簽拭去上層未轉移的細胞，結晶紫對下層細胞染色并計數。

1.4.7 劃痕實驗 首先在6孔板背面畫2～3條橫線。根據實驗分為對照組、Spermine組、siRNA MCU組，以每孔接種6×105個細胞。待細胞鋪滿后，用20 μL槍頭垂直于橫線劃痕。PBS洗滌并加入無血清的培養基，于0 h和48 h使用倒置顯微鏡拍照，使用IPP 6.0軟件分析。

1.4.8 Western blot 應用全蛋白提取試劑盒，提取前30 min配裂解液，4 ℃放置5 min，劇烈震蕩30 s，共5個循環，離心去除細胞碎片及雜質，分裝蛋白，應用蛋白含量檢測試劑盒檢測OD值，100 ℃ 10 min煮蛋白，上樣進行SDS-PAGE電泳。采用ECL化學發光顯影劑，曝光。應用Image J軟件測量條帶灰度值，以β-actin作為內參，不同時間點以兩者灰度值比值表示相對蛋白量。

1.5 統計學分析 所有數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，兩樣本均數的比較用t檢驗，多個樣本均數的比較用方差分析，率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化和免疫熒光檢測胃癌組織和癌旁組織中MCU蛋白的表達 MCU表達定位于細胞質，以棕黃色為陽性，免疫組化和免疫熒光結果均表明，胃癌組織中MCU陽性率為72.5%(58/80例)；癌旁組織中MCU陽性率為22.5%(18/80例)，兩組相比差異有統計學意義(P<0.01，圖1、2)。

2.2 Western blot法檢測胃癌組織和癌旁組織中MCU蛋白的表達 統計結果顯示，胃癌組織中MCU的表達顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。

AB

圖1 胃癌(A)組織和癌旁組織(B)中MCU蛋白的表達，SP法

圖2 胃癌(A)組織和癌旁組織(B)中MCU蛋白的表達，免疫熒光

圖3 Western blot法檢測胃癌和癌旁組織中MCU蛋白的表達

2.3 CCK-8實驗檢測Spermine對MGC-803細胞增殖的影響 應用CCK-8實驗檢測不同濃度的Spermine對MGC-803細胞增殖的影響，結果顯示MGC-803細胞增殖率隨著誘導劑濃度的增加逐漸降低(圖4)。本實驗選擇25 μmol/mL作為干預因素進行下一步實驗。

2.4 不同siRNA序列對MGC-803胃癌細胞MCU蛋白表達的影響 將針對MCU干擾靶向siRNA序列轉染MGC-803細胞，Western blot法檢測轉染48 h后各組細胞中MCU的蛋白表達，結果顯示，2條siRNA均能降低MCU的表達，與對照組和Control siRNA組相比，差異有統計學意義(P<0.01，圖5)，選擇抑制效果顯著的siRNA MCU-2序列作為實驗對象。

圖4 MCU誘導劑Spermine對MGC-803細胞增殖的影響

圖5 siRNA MCU對MGC-803細胞MCU蛋白表達的影響

2.5 MCU對MGC-803胃癌細胞線粒體膜電位的影響 利用JC-1法檢測不同分組中MGC-803細胞線粒體膜電位的影響，結果顯示，Spermine能夠顯著增加MGC-803細胞線粒體膜電位，且熒光強度較為聚集、細胞形態長梭形，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；siRNA MCU組顯著降低線粒體膜電位，與對照組相比熒光強度顯著減弱，差異有統計學意義(P<0.05，圖6)。

2.6 Transwell和細胞劃痕實驗檢測MCU對MGC-803胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響 Spermine能夠顯著增加MGC-803細胞侵襲和遷移的細胞數量，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)；siRNA MCU組能夠顯著降低MGC-803細胞侵襲和遷移能力，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01，圖7)。

圖6 不同分組對MGC-803胃癌細胞線粒體膜電位的影響

圖7 MCU對MGC-803胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響
*P<0.05,**P<0.01

2.7 Western blot法檢測MCU對MGC-803胃癌細胞HIF-1α、TGF-β、E-cadherin蛋白表達的影響 統計分析結果顯示，Spermine組能促進HIF-1α、TGF-β表達和降低E-cadherin蛋白的表達，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；siRNA MCU干擾后顯著降低HIF-1α、TGF-β表達和上調E-cadherin蛋白表達，與對照組和Spermine組相比，差異有統計學意義(P<0.05，圖8)。

圖8 MCU對MGC-803胃癌細胞中HIF-1α、TGF-β、E-cadherin蛋白表達的影響與對照組相比，*P<0.05；與Spermine組相比，#P<0.05

3 討論

線粒體在癌癥生物學中依賴多種分子發揮促癌作用[4]。線粒體發揮促癌的過程中，MCU通過調控線粒體鈣離子水平影響癌細胞的轉移[5]。根據人類蛋白質圖譜(www.proteinatlas.org)多數癌組織中MCU的表達存在差異[6]。MCU調節細胞存活率、代謝、基本細胞構建和免疫等功能，不僅影響癌癥的進展，還影響治療效果。MCU通過線粒體內膜將鈣轉運到線粒體基質影響癌細胞的增殖和凋亡[7]。雖然，以往研究結果表明MCU參與多部位癌轉移的過程，但是在胃癌細胞轉移中的作用并不清楚。

本組實驗結果表明，MCU在胃癌組織中高表達，并能促進胃癌細胞的侵襲和遷移。MCU通過調節線粒體膜電位影響癌癥的發展。Arduino等[8]的研究結果顯示，通過使用MCU特異性抑制劑能對血液惡性腫瘤發揮治療作用。Wiel等[9]的研究結果表明，IITPR2通過MCU通道導致線粒體鈣積累，影響線粒體膜電位、活性氧積累和癌細胞的衰老。本實驗利用JC-1法進行檢測，結果表明MCU的誘導劑Spermine能夠顯著增加線粒體膜電位的鈣離子累積，而siRNA MCU干擾組能顯著降低線粒體膜電位。結果提示MCU對于胃癌細胞的線粒體膜電位具有調節作用。

在癌癥研究中MCU的作用仍存在爭議。研究表明，在某些癌癥中特定的Ca2+通道調控機制不同，導致發揮的作用也不盡相同。先前的研究結果揭示，高表達的MCU能夠促進乳腺癌細胞的轉移，且預后較差[10]。在結腸癌研究中，RIPK1與MCU相互作用，通過增加線粒體鈣攝取和能量代謝促進癌細胞的增殖和轉移[11]。也有研究表明，促進MCU的表達能顯著抑制癌細胞的侵襲和遷移[12]。本實驗通過Transwell和細胞劃痕實驗表明，應用MCU誘導劑Spermine后，胃癌細胞侵襲和遷移能力顯著增強；而干擾MCU表達后，胃癌細胞侵襲和遷移能力顯著降低。該結果表明MCU在胃癌細胞中存在促癌轉移的作用。

上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)與鈣離子攝取密切相關[13]。眾所周知，EMT是癌轉移過程中的關鍵環節。在EMT過程中，HIF-1α和TGF-β信號被認為發揮著關鍵的作用[14-15]。然而，MCU對EMT及其相關信號因子的關系略有不同。有研究結果表明，在TGF-β誘導乳腺癌細胞侵襲和轉移過程中MCU存在調控作用[16]。也有研究結果顯示，在三陰型乳腺癌中發現MCU表達與腫瘤大小和淋巴結浸潤有關，提示MCU通過調節HIF-1α促進乳腺癌的進展[2]。本實驗應用Spermine能夠顯著增加胃癌細胞侵襲和遷移能力，并且促進HIF-1α和TGF-β蛋白的表達水平，干擾MCU后兩者表達顯著降低并伴有E-cadherin表達的增加。

本實驗檢測了胃癌組織和癌旁組織中MCU的表達，結果顯示MCU在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織。在線粒體膜電位的檢測中，MCU能夠調節胃癌細胞中線粒體鈣離子的攝取。MCU能促進胃癌細胞的侵襲和遷移，通過誘導和干擾MCU表達發現能影響HIF-1α和TGF-β的表達，表明MCU在促進胃癌細胞的過程中，對HIF-1α和TGF-β的表達具有調節作用。但是本實驗并未對HIF-1α和TGF-β表達進行干預，來進一步探討MCU的詳細作用機制，未來將進一步闡述。

綜上所述，本實驗揭示了MCU在胃癌組織中的表達水平以及促進胃癌細胞侵襲和遷移的作用。MCU能影響胃癌細胞中HIF-1α和TGF-β的表達。本實驗對MCU在癌癥中的作用提出了一些新參考，也為防治胃癌轉移提出新依據。