胃癌中FOXD3的表達及其與β-catenin表達的相關性

鄒長棪，林華妹，胡 丹，蘇 穎，夏 言，鄭雄偉,3，林賢東,3

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，病死率位居惡性腫瘤的第3位[1]。雖然近年胃鏡檢查等早期篩查手段逐漸得到重視，新輔助化療、手術、靶向藥物治療等腫瘤綜合治療手段顯著提高，但全球胃癌的發(fā)病率和病死率仍呈上升趨勢[1-2]。因此，探索胃癌在分子水平的發(fā)生、發(fā)展，積極尋找有效的早期檢測手段和治療方法是胃癌防治的迫切任務。叉頭框轉錄因子D3(forkhead box D3, FOXD3)是FOX轉錄因子家族的重要成員之一，參與胚胎發(fā)育和胚胎干細胞、神經(jīng)嵴細胞系的形成、遷移和分化[3]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的調(diào)控作用，慢性淋巴細胞白血病、黑色素瘤、結直腸癌、乳腺癌、肝癌和肺癌等均可見FOXD3異常表達[4-7]。本實驗采用免疫組化EnVision法和qRT-PCR法檢測FOXD3在胃癌及癌旁組織的表達，初步探討其表達水平與胃癌臨床病理特征及預后的關系，通過分析FOXD3與β-catenin表達的關系，探討FOXD3與腫瘤信號通路的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床標本 收集2014～2015年福建省腫瘤醫(yī)院存檔的78例胃癌手術切除標本，并取相應的癌旁組織作為對照組，患者術前均未接受過任何治療，術后經(jīng)病理學證實為胃癌。78例胃癌中，男性61例，女性17例，中位年齡61歲(39～82歲)。新鮮組織獲取后立即放入液氮保存，隨后轉入-80 ℃冰箱保存，整個收集過程及保存過程均按照無酶原則操作。隨訪時間從明確診斷開始至末次隨訪或死亡，以月為單位。本實驗經(jīng)福建省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準，所有納入患者均在術前簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 Trizol、qRT-PCR提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，qRT-PCR擴增試劑盒購自德國羅氏公司LightCycler 480 SYBR Green I Master，β-catenin購自北京中杉金橋公司，DAB顯色試劑盒購自羅氏公司。PCR擴增儀為Eppendof Mastercycler Gradient公司。qRT-PCR儀器為Roche LightCycler 480Ⅱ。全自動免疫組化染色儀為羅氏公司Benchmark XT。

1.3 qRT-PCR 取100 mg凍存新鮮組織液氮環(huán)境下研磨成粉末狀，加入1 mL Trizol，靜置10 min后抽提mRNA。使用分光光度計測定RNA濃度。按照逆轉錄試劑盒操作說明書將提取RNA逆轉成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩RT-PCR按照SyberGreen說明書配制反應體系，反應條件如下：95 ℃ 10 min、95 ℃ 2 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 10 s，40個循環(huán)；進行熔解曲線檢測。每個樣本設3個復孔，實驗重復3次。以GAPDH為內(nèi)參基因對各基因表達進行標準化，同時以T-177892癌組織表達為準(calibrator)對其他標本進行量化，即它的表達量設為1，量化其他樣本的表達量；采用2-ΔΔCt法計算相對表達量的RQ值，為了便于統(tǒng)計，把RQ值取lg進行分析[8]。

1.4 免疫組化 免疫組化染色采用EnVision法，將石蠟包埋組織4 μm厚切片，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。β-catenin(UMAB15，北京中杉金橋公司)為即用型抗體，用羅氏全自動免疫組化染色儀染色，孵育40 min，完成自動染色過程。陽性對照采用已知陽性病例，陰性對照用PBS代替一抗。β-catenin表達定位于胞核。染色評分標準：鏡下以細胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。采用半定量積分法判斷結果。(1)按陽性細胞百分率計分：陽性細胞數(shù)占1%～10%為1分，11%～50%為2分，≥51%為3分；(2)按細胞染色強度計分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結果相乘：0～4分為陰性，5～9分為陽性[9]。結果由兩位病理科醫(yī)師判定。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，配對資料的比較采用配對t檢驗；兩組間的比較先進行正態(tài)性檢驗及方差齊性分析，后進行兩獨立樣本t檢驗；采用χ2檢驗或Fisher精確概率法進行免疫組化結果分析；采用Spearman進行相關性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR法檢測FOXD3 mRNA在胃癌及癌旁組織中的表達 qRT-PCR法檢測78例胃癌及癌旁組織中FOXD3 mRNA的表達，結果顯示胃癌組織中FOXD3 mRNA的表達量為0.146±0.036(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，相應癌旁組織中的表達量為-0.379±0.107，上調(diào)3.35倍，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖1)。表明FOXD3 mRNA在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織。

2.2 FOXD3蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系 將78胃癌按照WHO組織分型，中+高分化胃癌組32例，F(xiàn)OXD3的表達量為0.24±0.04；低分化胃癌組46例，表達量為0.08±0.05，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.03)。按照Lauren分型，腸型胃癌組29例，F(xiàn)OXD3的表達量0.23±0.05；彌漫型胃癌組49例，表達量為0.09±0.05，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.04)，表明FOXD3表達與胃癌分化程度和Lauren分型密切相關。而FOXD3表達與患者性別、年齡，腫瘤部位、大小、淋巴結轉移、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯及EBER感染無顯著相關性(P>0.05，表1)。

圖1 qRT-PCR法檢測FOXD3 mRNA在胃癌及癌旁組織中的表達：紅線表示每組的平均值

表1 FOXD3蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系

*P<0.05

2.3 FOXD3表達與胃癌患者預后的關系 78例胃癌組織中FOXD3的相對表達量lgRQ符合正態(tài)分布，故取中位數(shù)0.18將其分為高表達量組(41例)和低表達量組(37例)。

78例胃癌患者從明確診斷開始隨訪，隨訪時間1～49個月，其中27例死亡，9例失訪。FOXD3高表達組36例，死亡19例(52.8%)，平均生存時間(31.7±3.1)個月；FOXD3低表達組33例，死亡8例(24.2%)，平均生存時間(38.4±2.7)個月。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，結果顯示FOXD3高表達組總體生存率(overall survival, OS)比低表達組差，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.046，圖2)。

圖2 FOXD3表達胃癌患者的生存曲線

2.4 胃癌組織中FOXD3表達與β-catenin表達的相關性 β-catenin是Wnt信號通路的關鍵蛋白，可將信號從胞質(zhì)傳到細胞核，啟動核內(nèi)特定基因的表達。正常情況下，β-catenin蛋白主要存在于正常細胞胞膜，基因突變后導致細胞核內(nèi)堆積。因此，β-catenin在核內(nèi)表達才確認為陽性(圖3A、B)。

AB

圖3 β-catenin在胃癌組織中的表達：A.β-catenin低表達；B.β-catenin高表達，EnVision法

據(jù)上述以FOXD3表達量的中位數(shù)(0.18)將78例胃癌患者分為高表達量組(41/78)和低表達量組(37/78)。在檢測β-catenin蛋白表達的基礎上，通過Spearsman等級相關法分析，結果顯示：FOXD3表達與β-catenin表達呈正相關(r=0.280，P=0.023，表2)。

表2 胃癌組織中FOXD3表達與β-catenin表達的相關性

3 討論

FOX蛋白家族是一類廣泛存在于動植物細胞中的轉錄因子，其在細胞凋亡的調(diào)節(jié)和細胞周期的調(diào)控、胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[10]。FOXD3是FOX轉錄因子家族的重要成員之一。FOXD3有維持脊椎動物胚胎發(fā)育和胚胎干細胞多能性，調(diào)控神經(jīng)嵴細胞系的形成、遷移和分化的功能，且在決定正常或惡性胚胎干細胞繼續(xù)增殖還是分化的過程中起關鍵作用[3,11]。據(jù)報道，F(xiàn)OXD3與其他轉錄因子相互作用，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的調(diào)節(jié)作用[12]。

本實驗通過qRT-PCR法檢測胃癌組織及相應癌旁組織中FOXD3的表達，結果顯示胃癌組織中FOXD3的表達量顯著高于癌旁組織，處于高表達狀態(tài)。王旭等[13]利用qRT-PCR和免疫組化法分析子宮頸癌組織及癌旁組織中FOXD3的表達[13]，結果顯示，F(xiàn)OXD3 mRNA及蛋白的表達水平均高于正常子宮頸組織。臧星卉等[14]在上皮性卵巢癌組織中的研究結果顯示FOXD3表達水平高于卵巢良性上皮性腫瘤組織和正常的卵巢，進一步研究表明，F(xiàn)OXD3可能參與上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。以上結果顯示，F(xiàn)OXD3在癌組織中呈高表達，與本組實驗結果一致。Chu等[6]在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，相對癌旁組織，乳腺癌組織中FOXD3呈低表達，F(xiàn)OXD3低表達與不良預后密切相關，進一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXD3高表達抑制腫瘤的侵襲轉移。以上結果表明，F(xiàn)OXD3在不同類型的組織樣本中存在異質(zhì)性，其功能也不盡相同。

本組實驗進一步分析了FOXD3的表達量與胃癌不同臨床病理特征的關系及患者術后OS的相關性，發(fā)現(xiàn)FOXD3表達與胃癌分化和Lauren分型密切相關，且胃癌組織中FOXD3高表達組OS較低表達組差(P<0.05)。在乳腺癌、直腸癌、肺癌、甲狀腺癌及惡性黑色素瘤等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)FOXD3異常表達與腫瘤臨床特征及預后密切相關。Bao等通過qRT-PCR分析131例肺癌血清中FOXD3的表達，發(fā)現(xiàn)FOXD3異常表達與TNM分期、淋巴結轉移和分化密切相關。ROC曲線表明，F(xiàn)OXD3可作為非小細胞肺癌患者的診斷生物學標志物[7]。印永祥等[15]在乳腺癌中研究顯示，F(xiàn)OXD3表達與淋巴結轉移密切相關，與其他類型乳腺癌相比，三陰型乳腺癌中FOXD3表達明顯增加。Li等[16]在分析胃癌TCGA數(shù)據(jù)結果表明，F(xiàn)OXD3的低表達和高表達的5年OS和無瘤生存率(disease free survival, DFS)分別為43.1%、55.9%和37.2%以及46.7%，高水平的FOXD3表達與不良的OS和DFS預后相關。以上結果均表明，F(xiàn)OXD3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可能是獨立的預后指標。

為了進一步探討FOXD3在胃癌中的作用，通過免疫表型分析FOXD3表達與Wnt/β-catenin信號相關蛋白的相關性，結果顯示：FOXD3表達與β-catenin表達呈顯著正相關。正常情況下，β-catenin蛋白主要存在于正常細胞的胞膜，基因突變后導致細胞核內(nèi)堆積。β-catenin是Wnt信號通路的關鍵蛋白，可將信號從胞質(zhì)傳到細胞核，啟動核內(nèi)特定基因的表達。以上結果提示，F(xiàn)OXD3異常表達與Wnt/β-catenin信號通路密切相關。Wnt/β-catenin信號通路是一類在生物體進化過程中重要的信號轉導通路，調(diào)控細胞的增殖、分化、極化、凋亡與抗凋亡等過程，該信號通路的異常與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病相關[17-18]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展也與Wnt/β-catenin信號的活化存在密切的聯(lián)系。其參與胃癌細胞的周期調(diào)控，促進細胞的增殖、侵襲、轉移等[19]。據(jù)報道FOXD3可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路促進小鼠外胚層干細胞的自我更新[20]。FOXD3/microRNA-496可調(diào)節(jié)Wnt信號通路影響人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨作用[21]。這些研究提示FOXD3可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路的功能有關，本組實驗結果顯示，F(xiàn)OXD3與β-catenin的表達呈正相關，但FOXD3是否通過Wnt/β-catenin促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展，仍需進一步深入探討。

綜上所述，本組實驗結果顯示，F(xiàn)OXD3在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，并且與腫瘤組織分化、Lauren分型及預后密切相關。FOXD3可能是判斷胃癌預后的分子標志物。FOXD3可能通過Wnt/β-catenin信號促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展，還有待于深入探討。