EAF2表達與前列腺癌上皮-間質轉化的關系及臨床意義

涂 健，洪 蔭，汪 娟，崔紅霞，眭怡群，馮一中，張永勝，

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一。近年由于新的輔助治療手段的推廣和腫瘤分子分型的廣泛應用，前列腺癌的發病率和病死率均有所下降，但這些新療法所帶來的毒副作用也越來越受到重視，前列腺癌仍然是男性死亡的重要原因之一[1]。上皮細胞-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是去勢抵抗性前列腺癌重要的耐藥機制之一，EMT是多步驟的變化過程，最終可致前列腺癌上皮表型消失而獲得間質表型，EMT可賦予腫瘤細胞轉移、侵襲以及干細胞特征[2-3]。EAF2是新發現的腫瘤抑制因子，最初作為前列腺中雄激素反應基因被發現[4]。EAF2在人前列腺癌組織和細胞系中的表達下調，EAF2的過表達可以誘導轉染的前列腺癌細胞凋亡并抑制腫瘤的生長[5]。但其與EMT的關系尚未見報道，本文現分析EAF2和EMT標志蛋白在前列腺癌組織中的表達，探討EAF2和EMT之間的關系及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集蘇州大學附屬第二醫院病理科存檔的82例前列腺癌組織和46例良性前列腺組織。82例前列腺癌患者年齡55～94歲，平均72.9歲，>70歲者51例，≤70歲者31例。前列腺癌組織按照2010年AJCC分期標準分期：Ⅰ+Ⅱ期35例，Ⅲ+Ⅳ期47例；有淋巴結轉移者20例；有隨訪資料者44例，隨訪時間61～96個月，平均72.8個月。所有患者均行手術切除治療，患者術前未接受放、化療或抗雄激素等治療。按照2016版與前列腺癌預后相關的WHO/ISUP分級分組系統將前列腺癌分為1～5個組別[6]。

前列腺組織芯片的制作：本實驗所有標本均來自蘇州大學附屬第二醫院病理科，蠟塊均保存完好，可直接進行組織芯片的制作(圖1)，111個樣品點，合計82例前列腺癌組織及29例良性前列腺組織。

1.2 試劑 EAF2兔抗人抗體購自Abcam公司，E-cadherin兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德生物公司；vimentin和N-cadherin兔抗人多克隆抗體均購自北京博奧森生物公司；免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自北京中杉金橋公司。

1.3 免疫組化 前列腺癌組織蠟塊標本4 μm厚切片，采用免疫組化SP法染色，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。一抗包括EAF2(1 ∶200)、E-cadherin(1 ∶300)、vimentin(1 ∶300)、N-cadherin(1 ∶300)，4 ℃孵育過夜。用PBS代替一抗作為陰性對照，已知染色陽性的前列腺癌組織切片作為陽性對照。

AB

圖1 前列腺癌組織芯片：A.組織蠟塊；B.HE切片

結果判定：EAF2表達定位于細胞核，按染色強度和陽性細胞數占腫瘤細胞總數的百分比計分。(1)按染色強度計分：細胞未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色3分；(2)按陽性細胞百分比計分：陽性細胞數占0～1%為0分，2%～24%為1分，25%～49%為2分，50～74%為3分，75～100%為4分；將兩項得分結果相乘：≥3分為陽性[7]。E-cadherin主要表達于細胞膜，>50%的細胞呈棕黃色顆粒為陽性；N-cadherin表達定位于細胞膜和(或)細胞質，>10%的細胞呈棕黃色顆粒為陽性；vimentin主要表達于細胞質，>10%的細胞呈棕黃色顆粒為陽性。

1.4 統計學分析 采用SPSS 18.0軟件對所有數據進行統計學分析，采用χ2檢驗和Pearson相關檢驗進行EAF2表達與EMT標志蛋白的相關性分析，采用Kaplan-Meier法進行生存分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EAF2在前列腺癌組織和良性前列腺組織中的表達 EAF2染色陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位于細胞核(圖2)。EAF2蛋白在良性前列腺組織中的陽性率為69.57%，顯著高于前列腺癌組織(40.24%)，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 EAF2在前列腺癌組織和良性前列腺組織中的表達[n(%)]

ABCD

圖2 EAF2在前列腺癌組織中的表達：A.陰性；B.弱陽性；C.中等陽性；D.強陽性，SP法

2.2 EMT標志物在前列腺癌組織和良性前列腺組織中的表達 免疫組化結果顯示，EMT相關標志物E-cadherin和N-cadherin表達定位于細胞膜，vimentin表達定位于細胞質(圖3)。前列腺癌組織中E-cadherin、vimentin和N-cadherin的陽性率分別為39.01%、21.95%和75.61%。良性前列腺組織中E-cadherin、vimentin和N-cadherin的陽性率分別為78.23%、15.74%和5.62%。

2.3 EAF2表達與前列腺癌臨床病理特征及預后的關系 EAF2蛋白表達與前列腺癌臨床分期(P=0.007，表2)、WHO/ISUP病理分組相關(P=0.016，表2)，與患者年齡、淋巴結有無轉移、脈管有無轉移及神經有無侵犯等均無關(P>0.05，表2)。生存分析結果顯示，前列腺癌組織中EAF2陽性患者的總生存期高于EAF2陰性患者(P=0.044，圖4)。

2.4 EAF2表達與前列腺癌EMT標志蛋白表達之間的關系 Pearson相關檢驗分析前列腺癌組織中EAF2的表達與E-cadherin、vimentin、N-cadherin的相關性，結果顯示，EAF2與E-cadherin表達呈正相關(r=0.363，P=0.001)，與vimentin(r=-0.255，P=0.021)和N-cadherin表達(r=-0.271，P=0.014)呈負相關(表3)。

ABC

圖3 EMT標志物在前列腺癌組織中的表達：A.vimentin；B.N-cadherin；C.E-cadherin，SP法

表2 EAF2表達與前列腺癌臨床病理特征的相關性

圖4 Kaplan-Meier法分析EAF2表達與前列腺癌患者生存時間的關系

表3 EAF2表達與前列腺癌EMT標志蛋白表達的相關性

3 討論

目前，前列腺癌的治療以手術切除、去勢治療以及放化療為主要治療手段，整體預后良好，但多數患者最終會轉變為去勢抵抗性前列腺癌，大量研究表明去勢抵抗性前列腺癌中腫瘤細胞出現了干細胞特征并表達分化特征的相關因子從而發生EMT[8-9]，EMT常表現為表面標記蛋白表達的變化：E-cadherin、cytokeratin等上皮標志物減少，vimentim、N-cadherin、fibronectin等間質標志物增加。因此，可以通過檢測這些標志物來鑒定EMT的發生[10]。EMT可以導致前列腺癌的治療抵抗以及轉移[11]，研究表明TGF-β在EMT中扮演重要角色，通過與雄激素受體(AR)軸相互作用，促進前列腺癌轉移、侵襲以及耐藥性[12]。

研究表明EAF2可以通過直接結合pVHL位點來調節低氧誘導因子(HIF1-α)以及腫瘤血管生成[13]。Chen等[14]發現在低氧條件下，HIF1-α可以誘導EAF2的表達上調，而EAF2可以抑制HIF1-α的轉錄活性。EAF2可以和抑癌基因p53作用來調節血栓反應蛋白1(TSP-1)進一步抑制內皮細胞的增殖和遷移[15]，本組實驗結果表明，EAF2在良性前列腺組織中的表達高于前列腺癌組織，提示抑癌基因EAF2可能抑制前列腺癌的發生、轉移。本組實驗結果提示，EAF2在臨床分期Ⅲ+Ⅳ期患者中的表達水平低于臨床分期Ⅰ+Ⅱ期患者，提示EAF2陰性者預后更差。而WHO/ISUP分級分組結果提示，前列腺癌高分組中EAF2蛋白表達水平低于前列腺癌低分組，WHO/ISUP分級分組和前列腺癌病理學Gleason評分和預后密切相關，因此本組實驗結果提示，EAF2蛋白表達和前列腺癌組織學分級以及預后具有一定相關性，生存分析結果表明，EAF2陽性前列腺癌患者的整體生存率高于EAF2陰性患者，表明其表達與患者預后有一定的相關性，其臨床意義有待深入探討。

研究表明EAF2和p53共同調節并抑制STAT3的表達和磷酸化過程，抑制了前列腺癌的生長[16]，而目前已知STAT3在前列腺癌及其他多種腫瘤中促進EMT的過程[17-19]，但EAF2與EMT的關系未見報道，作者在前列腺癌組織水平分析了EAF2的表達與EMT標志蛋白表達的關系，本組實驗結果表明，EAF2與E-cadherin表達呈正相關，與N-cadherin和vimentin表達呈負相關；進一步的檢測發現EAF2高表達的前列腺癌組織中，E-cadherin亦高表達，而vimentin和N-cadherin低表達，反之亦然，以上結果提示EAF2與前列腺癌的EMT表型有關，EAF2可能通過上調E-cadherin以及下調vimentin和N-cadherin的表達來抑制EMT的發生，從而抑制前列腺癌的侵襲、轉移，而EAF2與EMT具體的關聯和機制如何則有待積累大樣本進行深入分析。探討EAF2和EMT在前列腺癌中的表達水平及其相關性對揭示前列腺癌的發生、發展機制有指導意義，并為進一步的前列腺癌診斷和治療提供理論依據。