胃癌組織中BMAL1、GLI1的表達及意義

程 玉，劉海旺，郝美玲，薛 晶，齊潔敏

最新數(shù)據(jù)顯示，2018年全球新增胃癌病例100萬，死亡病例約78.3萬，約12例中有1例死于胃癌[1]。胃癌是我國第二大惡性腫瘤，發(fā)病率遠高于西方發(fā)達國家[2]。認識胃癌發(fā)病的分子機制有助于提高胃癌的診療水平。近年研究發(fā)現(xiàn)，破壞晝夜節(jié)律平衡會導致腫瘤的發(fā)生[3]，節(jié)律因子BMAL1能夠通過自身的表達調(diào)控和形成正負反饋通路而產(chǎn)生晝夜節(jié)律，其作為抑癌基因與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。目前，BMAL1在胃癌中是促癌作用還是抑癌作用尚存在爭議，且其調(diào)控胃癌發(fā)病的下游信號轉導途徑也未明確[4-6]。GLI1作為Hedgehog(HH)信號通路中重要的核內(nèi)轉錄因子，能激活下游靶基因從而調(diào)控增殖、分化等多種生理功能。GLI1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切，促進多種腫瘤的進展。胃癌中BMAL1與GLI1的表達是否具有相關性值得進一步探討。本實驗采用免疫組化SP法檢查胃癌中BMAL1和GLI1的表達及與臨床病理特征的關系，為探索BMAL1促進胃癌發(fā)生、發(fā)展的機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2014～2018年承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科存檔的90例石蠟標本，其中男性66例，女性24例，年齡38～81歲，中位年齡60歲，低分化52例，高中分化38例。根據(jù)2016年AJCC標準進行TNM分期，其中Ⅰ+Ⅱ期48例，Ⅲ+Ⅳ期42例。所有病例臨床、病理資料均完整，并經(jīng)病理檢查證實，患者術前均未行放、化療等輔助治療，患者均知情同意。另隨機抽取40例癌旁(距癌組織邊緣≥5 cm)組織作為對照組。

1.2 免疫組化 免疫組化染色采用EliVision兩步法。兔抗人BMAL1多克隆抗體(Ab93806，1 ∶200)及兔抗人GLI1多克隆抗體(Ab151796，1 ∶200)均購自美國Abcam公司。檸檬酸緩沖液高壓修復2 min，染色步驟嚴格按試劑盒說明書進行，DAB顯色。

1.3 結果判斷 由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，每張切片隨機選取5個高倍視野，采用雙評分法判斷。(1)按陽性細胞所占百分比計分：陽性細胞數(shù)≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。(2)按陽性細胞著色強度計分：細胞無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結果相乘作為最終評分，總分范圍為0～12分；以≤8分為低表達(陰性)，>8分為高表達(陽性)[7]。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗，兩指標相關性用Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 胃癌及癌旁組織中BMAL1、GLI1的表達 BMAL1和GLI1陽性定位于細胞核和細胞質。胃癌組織中BMAL1和GLI1的陽性率分別為86.7%(78/90)和83.3%(75/90)，兩者在癌旁組織中的陽性率分別為12.5%(5/40)和10.0%(4/40)。BMAL1和GLI1在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1，圖1～6)。

表1 BMAL1和GLI1在胃癌及癌旁組織中的表達

2.2 BMAL1、GLI1表達與胃癌臨床病理特征的關系 BMAL1表達與胃癌淋巴結轉移及TNM分期相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤最大直徑、分化程度無關(P>0.05)。GLI1表達與胃癌浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤最大直徑、分化程度無關(P>0.05，表2)。

表2 BMAL1和GLI1表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.3 胃癌組織中BMAL1與GLI1表達的相關性 本實驗中BMAL1和GLI1蛋白在胃癌中表達的秩相關系數(shù)為0.526(P<0.01)，即兩者表達呈正相關(表3)。

表3 胃癌組織中BMAL1和GLI1表達的相關性

3 討論

所有生物體的生理功能和行為均保持強健的晝夜節(jié)律，生物鐘基因(PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1)組成轉錄/翻譯正負反饋回路(TTFLs)，調(diào)控晝夜生物節(jié)律。轉錄因子BMAL1(又名ARNTL)位于TTFLs核心部位，在維持正常生物節(jié)律中起至關重要的作用[8-9]。越來越多的研究證實BMAL1參與腫瘤的多種生物學行為，并且其在腫瘤中的作用具有組織特異性，如BMAL1在胰腺癌、舌鱗狀細胞癌等惡性腫瘤中起抑癌作用，而在頭頸部腫瘤、髓細胞白血病等腫瘤中起促癌作用[10-13]。目前，關于BMAL1在胃癌中作用的研究相對較少，且研究結果不一致。Hu等[4]研究發(fā)現(xiàn)BMAL1在胃癌及癌旁組織中表達無差異，且與胃癌臨床生物學行為無關。魏柏等[5-6]報道BMAL1在胃癌組織中呈高表達，BMAL1的表達與患者年齡、腫瘤分化程度相關，并且認為BMAL1基因誘導胃癌細胞的增殖。研究結果的不一致，可能是因為樣本量不同所致。本實驗中發(fā)現(xiàn)BMAL1在胃癌中的表達明顯高于癌旁組織，提示BMAL1是胃癌組織和癌旁組織的差異蛋白，其可能在胃癌發(fā)生過程中起作用，與魏柏等研究結果一致。胃癌組織中，BMAL1在T3+T4組中的表達高于T1+T2組，淋巴結轉移N2+N3組中BMAL1表達高于N0+N1組，TNM分期Ⅲ+Ⅳ組中BMAL1的表達高于Ⅰ+Ⅱ組，表明BMAL1可能在促進胃癌侵襲轉移過程中發(fā)揮作用。

①②③④⑤⑥

圖1 BMAL1在癌旁組織中呈陰性，EliVision兩步法 圖2 BMAL1在高分化胃癌組織中呈陽性，EliVision兩步法 圖3 BMAL1在低分化胃癌組織中呈強陽性，EliVision兩步法 圖4 GLI1在癌旁組織中呈陰性，EliVision兩步法 圖5 GLI1在高分化胃癌組織中呈陽性，EliVision兩步法 圖6 GLI1在低分化胃癌組織中呈強陽性，EliVision兩步法

GLI1是HH信號通路中極其重要的一部分，可以激活大部分HH信號通路靶基因，該通路參與胚胎發(fā)生、組織分化、自我更新、體內(nèi)平衡和成體干細胞增殖[14]。哺乳動物中HH通路的組成部分有HH配體(DHH、SHH、IHH)、膜蛋白受體復合物Patched(PTCH)和Smoothened(SMO)、核轉錄因子GLI家族及下游靶基因。在正常生理情況下，PTCH抑制SMO蛋白活性，從而抑制HH下游通路，當PTCH和HH結合后，解除PTCH對SMO抑制作用，SMO進入胞質中，激活轉錄因子GLI，最后GLI鋅指轉錄因子(GLI1、GLI2、GLI3)移位進入細胞核，誘導調(diào)控細胞生長、存活和分化[15]。HH信號通路在胃癌的遠處轉移、不良預后和耐藥中起關鍵作用[16]。近期有研究指出，GLI1在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織，抑制GLI1基因的表達能夠抑制胃癌細胞增殖和遷移能力[17]。GLI1高表達促進胃癌細胞增殖遷移、誘導耐藥[18]。本實驗亦證實GLI1在胃癌組織中表達高于癌旁組織，隨著分化程度的降低，浸潤深度的增加，TNM分期的升高，GLI1的表達亦增高，提示GLI1在胃癌細胞的侵襲、轉移中具有重要作用。

目前，BMAL1與GLI1在胃癌中的表達是否有關聯(lián)尚不清楚，有文獻報道HH信號通路通過轉錄因子GLI與肝臟脂肪代謝晝夜節(jié)律相互反饋，BMAL1能調(diào)控HH信號通路核心基因[19]。本實驗分析胃癌中BMAL1和GLI1表達的相關性，結果顯示BMAL1和GLI1在胃癌中表達呈正相關，提示兩者可能協(xié)同促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展，具體機制尚有待體外細胞系實驗研究證實。

總之，BMAL1和GLI1在胃癌組織中高表達，兩者表達與胃癌浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期密切相關，GLI1表達亦與胃癌分化程度相關。兩者可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。BMAL1、GLI1在胃癌中的表達呈正相關，可能具有協(xié)同作用，為進一步探究BMAL1在胃癌中的作用提供線索。