低強度超聲體外抑制SMMC-7721細胞增殖

石明芳， 劉邦忠， 劉光華， 王 平， 楊名珍

復旦大學附屬中山醫院康復科，上海 200032

低強度超聲(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)是治療頻率和強度均較低的波，具有組織中易穿透、聲能吸收少、對組織損傷小的特點。LIPUS具有機械效應、空化效應和熱效應，被廣泛應用于臨床治療中，能夠有效促進骨折的愈合、軟組織修復、溶栓作用、感染炎癥的修復和促進藥物的滲透等。近年來，隨著對超聲生物學效應研究的深入，LIPUS成為腫瘤治療的一種新手段。研究[1]表明，正常細胞對LIPUS的作用具有抵抗力，而惡性腫瘤細胞對其很敏感。LIPUS能提高血腦屏障和血瘤屏障通透性，增加局部的藥物濃度，提高化療藥物的療效[2-3]。同時，在體內外環境下，LIPUS聯合微泡劑能有效促進腫瘤細胞中靶基因導入和表達[4]，增強基因治療腫瘤的效果。LIPUS作為一種新型的治療方法，對腫瘤細胞具有殺傷效應，并能協同其他治療手段，有望用于腫瘤治療，發揮抗癌效應[5]。

肝細胞癌(簡稱“肝癌”)是全球范圍內多發惡性腫瘤之一，發病率在男性中占腫瘤的第5位、致死率居腫瘤第2位，在女性中占腫瘤的第7位、致死率居腫瘤第6位[6]。由于大量慢性乙型肝炎和黃曲霉毒素感染人群的存在，中國肝癌發病率居高不下。在不斷完善優化現有治療手段的基礎上，進一步尋找新的治療技術和方法迫在眉睫。國內Sun等[7]用低強度聚焦超聲介導微泡破裂，用于治療兔VX2原位肝腫瘤，結果證實LIPUS可抑制VX2肝癌細胞的生長。本研究將LIPUS作用于肝腫瘤細胞系SMMC-7721細胞，觀察其對細胞增殖活性的影響，并篩選最優強度，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料和設備 人肝癌細胞系SMMC-7721細胞由復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所惠贈。DMEM 培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、雙抗(青霉素和鏈霉素)、胰蛋白酶、碘化丙啶(PI)均購于美國Gibco公司，膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)試劑盒購于美國Invitrogen公司，MTT試劑購于上海碧云天生物公司。酶標儀由德國Eppendorf公司生產，FACSort流式細胞儀由美國BD Biosciences公司生產，實驗用超聲治療儀由英國BTL公司生產。

1.2 SMMC-7721細胞培養及處理 將SMMC-7721細胞培養于含10%FBS、1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫孵育箱中。將處于對數生長期的SMMC-7721細胞接種于6孔板內，接種密度為0.5×106/mL；待細胞處于對數生長期且細胞活力>95%，80%～90%滿時，室溫下進行LIPUS處理。

LIPUS處理腫瘤細胞的方法參照Feril等[8]的實驗：將超聲探頭(有效面積5 cm2)垂直固定于6孔板底部(底面積9.5 cm2)，其間用耦合劑填充以隔絕空氣；頻率為1 MHz，工作周期為25%、時間為1 min，處理強度根據前期實驗[9]結果采用0.3、0.5、1.0、 1.3、 2.0 W/cm2。對照組超聲治療儀工作狀態：強度為0 W/cm2，頻率1 MHz，工作周期25%、時間為1 min，其他參數均與實驗組相同。細胞經LIPUS處理，孵育6 h后，置于倒置顯微鏡下觀察形態改變。每組設3個復孔。

1.3 MTT法測定細胞增殖抑制率 收集對數生長期的SMMC-7721細胞，按照5×103/孔細胞密度接種于96孔板中，每組設5個復孔，置于含10% FBS的DMEM培養基中培養(37 ℃，5% CO2恒溫孵育箱中)。培養24 h后，LIPUS組用LIPUS處理細胞，對照組予超聲探頭假照1 min，操作后繼續放入培養箱孵育。6 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)繼續培養4 h。吸掉上清后，每孔加入50 μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速震蕩20 min，最后采用酶聯免疫檢測儀測量各孔吸光度(OD,490 nm)。上述步驟均重復3次。細胞存活率=(實驗組OD值÷對照組OD)×100%。根據SMMC-7721細胞存活率，篩選出超聲最佳作用強度。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 待細胞生長至對數生長期時，LIPUS組采用MTT法結果確定的最佳作用強度處理，對照組用超聲探頭假處理。處理后繼續孵育6 h，收集細胞，PBS重懸計數；取5×105個細胞加入195 μL Annexin V-FITC結合液重懸，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI混勻，室溫避光孵育15 min；采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

2 結 果

2.1 LIPUS對SMMC-7721細胞增殖活性的影響 以對照組細胞存活率為100%，結果(表1)表明：0.3 W/cm2組細胞存活率與對照組差異無統計學意義(P<0.05)；0.5 W/cm2及以上強度組細胞存活率逐漸下降，呈強度依賴性，與對照組差異均有統計學意義(P<0.05)。0.5 W/cm2組細胞存活率與0.3 W/cm2組差異有統計學意義，與1.0 W/cm2組差異無統計學意義；1.3 W/cm2組細胞存活率與1.0 W/cm2組差異有統計學意義，與1.5 W/cm2組差異無統計學意義。最終確定0.5 W/cm2、1.3 W/cm2、2.0 W/cm2強度用于后續實驗。

表1 超聲處理1 min后SMMC-7721孵育6 h 存活率

注：細胞存活率以對照組為100%計算.*P<0.05，**P<0.01與對照組相比；n=5

2.2 LIPUS對SMMC-7721細胞凋亡率和壞死率的影響 流式細胞術檢測(圖1)顯示：預處理1 min后孵育6 h，對照組僅有0.24% annexin V-FITC陽性細胞(凋亡細胞)，0.5、1.3 、2.0 W/cm2組細胞凋亡率分別為4.66%、8.99%、32.41%，與對照組差異有統計學意義(P<0.01)。對照組未見PI陽性細胞(壞死細胞)，0.5、1.3 、2.0 W/cm2組細胞壞死率分別為0.3%、0.8%、1.8% 。

圖1 流式細胞術檢測超聲處理1 min后孵育6 h細胞凋亡率和壞死率

3 討 論

超聲治療作為康復醫學的一個重要治療手段，在骨關節疾病、疼痛的治療方面發揮了巨大作用。近年來，國內外將LIPUS用于腫瘤細胞體外實驗，取得可喜進展[8,10-11]。LIPUS具有多方面的生物學效應，包括空化效應、機械效應和熱效應[12]。在超聲作用下，介質中產生自由基及過氧化物質，同時超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活力降低，從而誘導酶失活和脂質體解聚、氧自由基的清除減少，最終殺傷細胞[5,13]。此外，超聲在傳播過程中能使介質點進入振動狀態，導致細胞膜透化、細胞間連接破壞，促進腫瘤細胞DNA損傷[14]、改變骨架基礎蛋白[15]，促進細胞凋亡。有學者認為，超聲波在介質內傳播的過程中，其能量不斷被吸收而使介質溫度升高，產生熱效應，而當超聲能量被組織吸收轉為熱量而溫度升高時，正常組織可通過血流循環而散熱，癌變組織則因血流少、散熱差，溫度易超出周圍組織5～9 ℃[16]。基于以上理論，LIPUS被廣泛用于腫瘤研究。LIPUS單獨應用或聯合應用微泡劑產生的空化泡載體，不僅能增加細胞膜的通透性，同時能增加化療藥物在局部的濃度并增加靶細胞的敏感性，促進基因導入和表達[17]。

本研究將不同強度的超聲作用于SMMC-7721細胞，檢測其對細胞的增殖活性。結果顯示，經0.5 W/cm2及以上強度的LIPUS處理后，細胞的存活率明顯下降，與對照組差異有統計學意義(P<0.05)，說明LIPUS能夠抑制SMM-7721細胞的增殖活性。而0.3 W/cm2組細胞存活率與對照組差異無統計學意義。Feril等[8]用LIPUS誘導U937(人組織細胞淋巴瘤細胞株)時發現，自由基(·OH)僅在0.3 W/cm2以上強度超聲處理細胞時才可被檢測到；氧化應激指示劑血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)在0.3 W/cm2強度超聲下也無明顯變化，當處理強度達到0.4 W/cm2時，HO-1表達迅速上調至對照組的12倍，這與本研究結果相一致。本研究中MTT結果顯示，LIPUS組隨著超聲作用強度增大，SMMC-7721細胞存活率逐漸下降，呈一定的強度依賴性。

目前國內外超聲輻照腫瘤細胞的強度為0.05～5.12 W/cm2，對于LIPUS的界定并無明確的范圍，國外一般以超聲功率小于3或5 W/cm2作為低強度標準[18]，國內目前一般要求不超過2 W/cm2[19]。本研究采用的BTL-5720型超聲治療儀治療強度范圍為0～3 W/cm2，而臨床多采用在0.3～1.3 W/cm2。因此，本研究將0.5、1.3、2.0 W/cm2作為處理強度用于凋亡檢測及后續研究。本研究顯示，對照組細胞凋亡率為0.24%，LIPUS組隨超聲強度的增大，SMMC-7721的凋亡率逐漸升高。 LIPUS能誘導SMMC-7721細胞凋亡，同時致細胞壞死率較低。細胞凋亡在腫瘤形成的不同階段均具有十分重要的作用，而壞死則可引起局部炎癥反應，因此誘導腫瘤細胞凋亡并減少壞死是抗癌的重要思路。

綜上所述，LIPUS能抑制肝腫瘤細胞系SMMC-7721細胞的增殖活性，誘導其凋亡，其效應呈強度依賴性。LIPUS有定位準確、組織穿透力強、簡便易行的特點，易被患者接受，成為研究腫瘤治療的一個新方向。目前研究主要針對LIPUS單獨或聯合其他治療方法作用于腫瘤細胞的效應，而尚未揭示其抑制癌細胞活性、促進腫瘤細胞凋亡的分子生物學機制。若能從分子水平揭示LIPUS選擇性的促進腫瘤細胞凋亡而不影響正常細胞的活性，以及同其他治療方法協同作用的機制，則將為臨床靶向治療腫瘤提供更多的理論依據。