流感雙解方抑制甲型H1N1流感病毒的體外實驗研究

周雅萍 李國春 關(guān)曉偉

[摘要] 目的 分析流感雙解方抑制甲型H1N1流感病毒的體外實驗。 方法 24只新西蘭白兔隨機分為三組，每組8只。分別給予流感雙解方、利巴韋林、生理鹽水灌胃并制含藥血清，分析藥物抑制甲型H1N1流感病毒效果。 結(jié)果 甲型H1N1流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/PR8/34（H1N1）TCID50為10-4.575/100 μL。流感雙解方與利巴韋林含藥血清最大細胞無毒濃度分別為40%與50%。預(yù)防感染、直接殺活與復(fù)制增殖抑制實驗均顯示，病毒感染組OD值低于細胞組（P < 0.05），利巴韋林組和流感雙解方組OD值均高于病毒感染組（P < 0.05）;利巴韋林組和流感雙解方組病毒抑制率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 流感雙解方具有體外預(yù)防、直接殺滅和感染后抑制甲型H1N1流感病毒作用。

[關(guān)鍵詞] 流感雙解方;甲型H1N1流感病毒;抗病毒;利巴韋林

[中圖分類號] R285.5 ? ? ? ? ?[文獻標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（c）-0028-04

Study on inhibition of influenza A virus by influenza Shuangjie Decoction in vitro experimental

ZHOU Yaping ? LI Guochun ? GUAN Xiaowei

School of Medicine & Holistic Integrative Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing ? 210023， China

[Abstract] Objective To analysis inhibition of influenza A virus by influenza Shuangjiefang Decoction in vitro experimental. Methods Twenty-four New Zealand white rabbits were random divided into three groups， eight per group. Influenza Shuangjiefang Decoction， Ribavirin， and normal saline were given by gavage and drug-containing serum was prepared to analyze the effect of drugs on inhibiting influenza A virus. Results The influenza A virus rat lung adaptation strain A/PR8/34 （H1N1） TCID50 was 10-4.575/100 μL. The maximum non-toxic concentration of influenza Shuangjiefang Decoction and Ribavirin-containing serum were 40% and 50%， respectively. The experiments prevent infection， direct inactivation and replication proliferation inhibition showed that the OD value of the virus infection group was lower than that of the cell group （P < 0.05）; the OD value of the ribavirin group and the influenza Shuangjiefang Decoction group were higher than that of the virus infection group （P < 0.05）. There was no statistically significant difference in virus inhibition rate between the ribavirin group and the influenza Shuangjiefang Decoction group （P > 0.05）. Conclusion Influenza Shuangjiefang Decoction has the functions of in vitro prevention， direct killing and inhibition of influenza A virus after infection.

[Key words] Influenza Shuangjie Decoction; Influenza A virus; Antiviral; Ribavirin

流感病毒（IFV）是具有囊膜、多節(jié)段的單股負鏈RNA病毒，屬于正黏病毒科[1]。根據(jù)抗原性差異和基因特性差異，主要存在甲、乙、丙3種類型的病毒，而流行病學(xué)上最容易發(fā)生的是甲型流感病毒[2-3]。流感雙解方是國醫(yī)大師周仲瑛所擬抗呼吸道病毒方，臨床研究顯示其能有效促進肺炎吸收和流感病毒抗原轉(zhuǎn)陰[4-5]。本實驗主要分析流感雙解方對甲型H1N1流感的預(yù)防、直接殺滅與抑制作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

犬腎上皮細胞株（MDCK）、甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/PR8/34（H1N1），均由江蘇省疾病預(yù)防控制中心提供。

DMEM培養(yǎng)基（上海博湖生物科技有限公司）;四甲基偶氮唑鹽（上海聯(lián)碩生物科技有限公司）;新生牛血清（南京全隆生物技術(shù)有限公司）;胰酶（上海中西三維藥業(yè)有限公司）。96孔微孔混勻儀（QB-8001，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;CO2培養(yǎng)箱（JYWD8698，北京金洋萬達科技有限公司）;臺式冷凍離心機（5810R型，Eppendorf公司）;酶聯(lián)免疫檢測儀（HBS-1096B，上海賀琛能源科技有限公司）。

1.2 實驗動物

選擇南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心的SPF級健康雄性新西蘭白兔24只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，平均（2.2±1.2）kg。飼養(yǎng)條件：濕度7%～10%，溫度25℃左右，每日光照12 h，予以普通兔飼料、飲用級純凈水常規(guī)飼養(yǎng)，保持環(huán)境清潔衛(wèi)生與通風(fēng)。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 實驗藥物

流感雙解方（南京中醫(yī)藥大學(xué)百草堂），根據(jù)實驗動物臨床用藥劑量原則[6-7]，濃縮至濃度為0.908 g/mL;利巴韋林顆粒（山東立強藥業(yè)股份有限公司），稀釋藥物濃度為0.456 mg/mL;均置于4℃冰箱保存[8]。

1.4 方法

1.4.1 含藥血清的制備 ?24只白兔于實驗室飼養(yǎng)3 d后，隨機分為三組，每組8只。第4～6天進行不同方式的灌胃處理，2次/d。其中空白血清組給予50 mL生理鹽水，流感雙解方組灌胃量36.32 mg/（kg·d），利巴韋林組18.24 mg/（kg·d）。第6天給藥完畢1 h后，進行頸動脈采血，務(wù)必保證白兔是在清醒的狀態(tài)下，采集的標(biāo)本靜置3 h后，3000 r/min（離心半徑15 cm）離心15 min后取上清液，56℃水浴滅活30 min，過濾后分組保存，保持-20℃。

1.4.2 細胞病變（CPE）法測定病毒對MDCK細胞的半數(shù)感染量（TCID50） ?MDCK細胞以1×105個/mL細胞濃度接種，100 μL/孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱（余下實驗培養(yǎng)箱溫濕度條件相同）培養(yǎng)，甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/PR8/34（H1N1）病毒懸液用維持液10倍稀釋（10-1～10-8）8個濃度。待發(fā)現(xiàn)MDCK細胞為單層時，吸棄培養(yǎng)液，再進行磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，接種不同濃度的H1N1病毒懸液，100 μL/孔，并使其均勻吸附，吸棄病毒液后每孔加入含2%小牛血清維持液100 μL繼續(xù)培養(yǎng)，即時觀察病變。正常細胞對照孔則加入100 μL維持液;以最高稀釋度不再出現(xiàn)新病變時為終點，觀察出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)（CPE）的孔數(shù)，無病變?yōu)椋?），≤25%細胞病變?yōu)椋?），>25%～50%為（++），>50%～75%為（+++），>75%為（++++）。根據(jù)Reed-Muench法[9]計算TCID50：距離比=（高于50%百分數(shù)-50%）/（高于50%百分數(shù)-低于50%百分數(shù)），TCID50=距離比+高于50%病變病毒最高稀釋度的對數(shù)。

1.4.3 MTT法測藥物最大無毒濃度 ?MDCK細胞以1×105個/mL細胞濃度接種，長成單層后，分別加入不同濃度（10%～100%）的流感雙解方、利巴韋林含藥血清，并設(shè)正常細胞對照組。培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，使其均勻吸附，培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，測定各孔光密度值（OD值），計算各藥物的最大無毒濃度。上述三組均以每組8只新西蘭白兔的血清標(biāo)本按1～8標(biāo)簽逐次實驗，取其均值分析。細胞存活率=加藥組OD值/對照組OD值×100%。以細胞存活率≥90%作為藥物最大無毒濃度。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 藥物對病毒感染的預(yù)防作用 ?0.25%胰酶消化單層MDCK細胞，以1×105個/mL的細胞濃度接種培養(yǎng)。待細胞長滿所需密度（80%～90%）時吸去培養(yǎng)液，PBS洗兩遍。分為細胞組、病毒組、利巴韋林組和流感雙解方組，每組8份，按血清標(biāo)本1～8標(biāo)簽逐次加入藥物血清。藥物組加入相應(yīng)藥物，細胞對照組與病毒組加入細胞維持液。培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液，PBS洗兩遍。除細胞組加維持液外，其他三組細胞均用100 TCID50/100 μL IFV感染;逐日在倒置顯微鏡下觀察，直至發(fā)現(xiàn)病毒感染組細胞CPE達（++++）時加入預(yù)先過濾除菌5 mg/mL的MTT溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸去上清液，加入DMSO溶液150 μL/孔，測定OD值。通過公式計算藥物對病毒的抑制率：病毒抑制率（%）=（藥物組平均OD值-病毒感染組平均OD值）/（細胞對照組平均OD值-病毒感染組平均OD值）×100%。觀察藥物對病毒的預(yù)防作用。

1.5.2 藥物對病毒感染的直接滅活作用 ?分別將流感雙解方血清、利巴韋林血清與等體積的100 TCID50流感病毒在無菌EP管中混勻，置培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，按照“1.5.1”方法進行MDCK細胞的培養(yǎng)及分組。除病毒組應(yīng)用100 TCID50/100 μL IFV感染外，其余組均加入維持液100 μL;經(jīng)培養(yǎng)箱吸附、PBS清洗等操作后，三組分別加入利巴韋林血清和病毒混合液、流感雙解方血清和病毒混合液、細胞維持液，100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;余下步驟同“1.5.1”。觀察藥物對病毒的直接滅活作用。

1.5.3 藥物對病毒吸附后復(fù)制增殖的抑制作用 ?按照“1.5.1”方法進行MDCK細胞的培養(yǎng)、分組，用100 TCID50/100 μL IFV感染各組細胞（細胞組不感染，加維持液100 μL）;進行培養(yǎng)箱吸附、PBS清洗等操作后，分別加入利巴韋林血清、流感雙解方血清、細胞維持液，100 μL/孔，培養(yǎng)4 h;余下實驗步驟同“1.5.1”。觀察藥物對病毒吸附后復(fù)制增殖的抑制作用。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

選擇SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFV干預(yù)MDCK細胞出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)情況

MDCK細胞中流感病毒H1N1亞型TCID50為10-4.575/100 μL。IFV干預(yù)MDCK細胞出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)情況見表1。

表1 ? IFV干預(yù)MDCK細胞出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)情況

注：IFV：流感病毒;CPE：細胞病變效應(yīng)

2.2 不同濃度含藥血清對MDCK細胞存活率的影響

正常對照組細胞存活率為100%，流感雙解方組與利巴韋林組不同濃度含藥血清的MDCK細胞存活率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。流感雙解方與利巴韋林含藥血清最大細胞無毒濃度分別為40%（0.363 g/mL）、50%（0.228 mg/mL）。

表2 ? 不同濃度含藥血清對MDCK細胞存活率的影響（%，x±s，n = 8）

注：正常對照組細胞存活率為100%

2.3 四組預(yù)防感染、直接滅活及復(fù)制增殖抑制OD值比較

病毒感染組預(yù)防感染、直接滅活及復(fù)制增殖抑制的OD值明顯低于細胞對照組（P < 0.05）;利巴韋林組和流感雙解方組OD值均高于病毒感染組（P < 0.05）;利巴韋林組與流感雙解方組間OD值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

表3 ? 四組預(yù)防感染、直接滅活及復(fù)制增殖抑制OD值比較

（x±s，n = 8）

注：與細胞對照組比較，△P < 0.05;與病毒感染組比較，*P < 0.05

2.4 兩組預(yù)防感染、直接滅活及復(fù)制增殖抑制病毒抑制率比較

兩組預(yù)防感染、直接滅活、復(fù)制增殖抑制的病毒抑制率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表4。

表4 ? 兩組預(yù)防感染、直接滅活及復(fù)制增殖抑制病毒抑制率比較

（%，x±s，n = 8）

3 討論

中藥抑制甲型H1N1流感病毒取得不錯療效[10-13]。周仲瑛教授針對流感病毒遵循“氣營兩清、表里雙解、祛邪外達”的原則，流感雙解方是其防治外感熱病的臨證經(jīng)驗方，具有清氣瀉熱、涼營解毒等功效[14-16]。為此，本研究以新西蘭白兔為實驗對象，分析了流感雙解方對甲型H1N1流感病毒的抑制作用及應(yīng)用價值。

實驗中，甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/PR8/34（H1N1 TCID50為10-4.575/100 μL。分別篩選出濃度40%（0.363 g/mL）的流感雙解方、50%（0.228 mg/mL）的利巴韋林含藥血清為最大細胞無毒濃度。在含藥血清濃度超過上述值時，會發(fā)生明顯的細胞病變，出現(xiàn)細胞皺縮、細胞間隙變大、胞質(zhì)不透明、粗糙、部分細胞脫落等現(xiàn)象[17]。因此認為，將≤0.363 g/mL的流感雙解方用于甲型流感病毒感染的新西蘭白兔體外實驗時，細胞存活率>90%。

進一步實驗顯示，IFV感染MDCK細胞后，藥物對H1N1亞型流感病毒預(yù)防感染、直接滅活及病毒吸附后復(fù)制增殖抑制的OD值較病毒感染組均有明顯升高。OD值作為被檢測物吸收掉的光密度值，通過檢測OD值能夠了解藥物對MDCK細胞活性的保護作用。OD值越高，提示活細胞數(shù)量越多、細胞活性越佳[18]。本研究顯示，流感雙解方用于H1N1亞型流感病毒預(yù)防感染、直接滅活及吸附后復(fù)制增殖抑制時，均能獲得較好的干預(yù)效果，細胞活性率佳;流感雙解方組所檢測OD值與利巴韋林組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），提示流感雙解方應(yīng)用于H1N1亞型流感病毒治療中時能獲得與利巴韋林相似的效果。在兩種藥物的病毒抑制率比較中，無論是藥物對流感病毒預(yù)防感染的抑制率，還是對直接滅活和病毒吸附后復(fù)制增殖抑制的抑制率，流感雙解方組與利巴韋林組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），這進一步肯定流感雙解方用于H1N1亞型流感病毒治療中的理想效果。

H1N1亞型流感具有起病急、傳變快等特點，早期表現(xiàn)為邪由表入里，里熱漸起，繼而傳營入里。因此，在治療上需遵循“表里雙解、汗和清下”的辨證治療思路[19-20]。流感雙解方作為治療外感熱病的經(jīng)驗方，能通過多途徑、多靶點滅活流感病毒，抑制病毒吸附與增殖，從而充分發(fā)揮對H1N1亞型流感病毒感染的治療作用。其主要由金銀花、連翹、北柴胡、荊芥、酒大黃、生石膏、知母、黃芩、淡竹葉、蘆根等十余味中草藥所組成[21-22]，諸藥合用，共奏療效，對減輕炎性病變、抑制細胞凋亡有良好作用。

綜上，流感雙解方在H1N1亞型流感病毒感染的預(yù)防、直接滅活和復(fù)制增殖抑制方面均有較為理想的抑制作用。本研究可為中醫(yī)藥抑制流感病毒的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，能在一定程度上促進中醫(yī)藥診治重大疾病的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

[參考文獻]

[1] ?包旦奇，劉芹防.流感病毒出芽模型與分子機制研究進展[J].中國動物傳染病學(xué)報，2018，26（3）：1-6.

[2] ?洪彩華，鐘武.新型抗流感病毒藥物研究進展[J].中華實用兒科臨床雜志，2019，34（2）：107-116.

[3] ?Li H，Cao B. Pandemic and Avian Influenza A Viruses in Humans：Epidemiology，Virology，Clinical Characteristics，and Treatment Strategy [J]. Clin Chest Med， 2017，38（1）：59-70.

[4] ?王濤，劉宏祥，王穎，等.清熱化痰解毒方對腦缺血再灌注大鼠肺組織TXNIP/NLRP3炎性通路的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2018，24（12）：163-164.

[5] ?韓夢莉.流感雙解方辨治病毒性肺炎的隨機對照試驗研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[6] ?周智剛，段志剛，王宏，等.非人靈長類個性化麻醉方案的探討[J].中國實驗動物學(xué)報，2019，27（4）：473-478.

[7] ?胡敏，趙宏斌，董錫亮，等.恒古骨傷愈合劑對激素性股骨頭壞死兔模型干預(yù)的組織外觀和光鏡觀察[J].中國中藥雜志，2010，35（21）：2912-2916.

[8] ?陳遠彬，林琳，吳勉華，等.“汗和清下、表里雙解”復(fù)法治療流行性感冒的研究思路與方法[J].遼寧中醫(yī)雜志，2018， 1（1）：50-52.

[9] ?楊海玉，馬智龍.應(yīng)用TCID50法比較4種細胞對呼吸道腺病毒的敏感性[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，41（23）：4345-4346.

[10] ?王學(xué)文.復(fù)方中藥制劑對甲型流感病毒感染的抑制作用及其作用機制的研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[11] ?崔振澤，黃燕，徐超，等.定喘湯對呼吸道合胞病毒感染大鼠細胞免疫調(diào)節(jié)作用的量效關(guān)系研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2016（9）：2067-2070.

[12] ?杜海霞，萬海同，何昱等.銀花平感顆粒的體外抗甲型H1N1流感病毒作用[J].中醫(yī)雜志，2017，58（23）：2039-2044.

[13] ?王變利，高燕，趙秀香，等.金銀花水提物體外抗病毒實驗研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2015，42（8）：1495-1497.

[14] ?郭立中，金妙文，周學(xué)平，等.周仲瑛教授對防治甲型H1N1流感的思考[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2010，3（1）：29-31.

[15] ?任攀，梅玉發(fā)，王敏，等.金菌清熱口服液對甲型H1N1流感病毒致細胞病變效應(yīng)的影響[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2017，37（23）：2348-2351.

[16] ?周仲瑛，葉放，周珉.周筱齋教授辨治外感熱病學(xué)術(shù)思想與臨床經(jīng)驗[J].江蘇中醫(yī)藥，2016，48（4）：1-5.

[17] ?姜晨彥，聶世嬌，呂錫宏，等.犬腎傳代細胞分離流行性感冒病毒致細胞病變的敏感性[J].中華傳染病雜志，2010，28（7）：390-392.

[18] ?劉素貞，曹曉敏，許麗娟，等.應(yīng)用CCK8法檢測雞淋巴細胞活性的檢測最佳條件研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（7上）：212-214.

[19] ?封繼宏.“寒溫雙解、疏利透邪”法治療流行性感冒的提出及其機制研究思路探討[J].遼寧中醫(yī)雜志，2011，414（11）：2161-2162.

[20] ?李紅娟，黃浩明，左俊嶺.銀翹柴桂Ⅱ號方抗甲型流感病毒的免疫調(diào)節(jié)機制研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2018，4（4）：449-453.

[21] ?劉琪，王建國，雷文婷，等.疏風(fēng)宣肺解毒方對流感病毒性肺炎小鼠肺組織Toll樣受體3通路的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2018，5（5）：522-525.

[22] ?陳遠彬，何冰，林琳，等.流感雙解方治療輕型流感病毒性肺炎26例臨床觀察[J].中醫(yī)雜志，2017，58（2）：128-132.

（收稿日期：2019-10-25 ?本文編輯：王曉曄）