依達(dá)拉奉對大鼠腦梗死急性期神經(jīng)功能的影響

腦梗死是目前全球范圍內(nèi)的常見病、多發(fā)病，具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率特點(diǎn)，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量，占全部腦卒中的60%～80%[1-2]。近年來腦梗死急性期的治療有一定進(jìn)展，然而神經(jīng)元結(jié)構(gòu)錯綜復(fù)雜，導(dǎo)致腦功能恢復(fù)困難重重[3]。目前臨床治療且具有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的清除自由基藥物包括依達(dá)拉奉，其是治療急性腦梗死的常用藥，通過抗氧化和清除自由基，抑制神經(jīng)元氧化損傷，具有抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)作用[4]。本研究探討依達(dá)拉奉對大鼠腦梗死急性期神經(jīng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠購于維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，體重250～300 g，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)動物房，所有造模及取材流程符合首都醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會要求。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 依達(dá)拉奉購自昆明積大制藥股份有限公司，產(chǎn)品批號170507，大鼠給藥劑量為10 mg/kg。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模 根據(jù)Longa等[5]報道建立大鼠永久性腦缺血模型(MACO)的方法。采用10%水合氯醛麻醉后，仰臥位固定于鼠板上。頸部正中縱行切開，暴露左側(cè)頸動脈三角，逐層分離組織，剝離頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)，使用眼科剪在頸內(nèi)動脈剪一楔形切口，插入頭部圓球形魚線，插入深度16～18 mm，阻斷左側(cè)大腦中動脈血流供應(yīng)。假手術(shù)組僅分離頸總動脈，不插入魚線。

1.2.2 Bederson神經(jīng)功能評分 采用Bederson法[6]評估腦梗死后大鼠神經(jīng)功能，評分方法見表1。總分為10分，評分越高提示神經(jīng)功能缺損越重。造模后隨即進(jìn)行評分，此后第1天、第3天、第7天相同時間分別再次進(jìn)行評分。

表1 Bederson評分表 單位：分

1.2.3 分組及給藥 SD大鼠分為假手術(shù)組(6只)、模型組與依達(dá)拉奉組各18只，每個時間各6只，其中3只用于免疫組化，3只用于蛋白免疫印跡和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。SD大鼠造模成功后隨機(jī)分為模型組與依達(dá)拉奉組，假手術(shù)組大鼠僅分離頸總動脈，不進(jìn)行結(jié)扎。造模后立即給藥，腹腔注射依達(dá)拉奉注射液，劑量為10 mg/kg。

1.2.4 取材及指標(biāo)檢測 造模后第1天、第3天、第7天麻醉大鼠，斷頭取腦，剝離缺血腦半球，制備組織勻漿，提取蛋白及總RNA。分別進(jìn)行蛋白免疫印跡(Western Blot)及實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測，選取GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表2，每組至少3個樣本。

表2 qPCR所用的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 依達(dá)拉奉對大鼠腦梗死急性期神經(jīng)功能評分的影響 采用Bederson神經(jīng)功能評分量表評估MCAO大鼠腦梗死急性期神經(jīng)功能變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦梗死后3 d內(nèi)依達(dá)拉奉組與模型組Bederson神經(jīng)功能評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第5天及第7天依達(dá)拉奉組Bederson神經(jīng)功能評分均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。

與模型組比較，＊P<0.05。

2.2 依達(dá)拉奉對MCAO大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量的影響 造模成功后第1天、第3天、第7天取患側(cè)半球腦組織，石蠟包埋后切片，采用免疫組化方法，以NeuN標(biāo)記神經(jīng)元，選取代表性圖片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，見圖2A。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組海馬區(qū)神經(jīng)元明顯減少，依達(dá)拉奉組第3天、第7天神經(jīng)元數(shù)量明顯多于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，詳見圖2B。

a：假手術(shù)組；b：模型組第1天；c：模型組第3天；d：模型組第7天；e：依達(dá)拉奉組第1天；f：依達(dá)拉奉組第3天；g：依達(dá)拉奉組第7天。與模型組同時間比較，＊P<0.05，#P<0.01。

(A：各組不同時間石蠟切片圖；B：各組海馬區(qū)神經(jīng)元IOD比較)

2.3 依達(dá)拉奉對MCAO大鼠腦梗死急性期缺血腦半球Bcl-2及Bax蛋白含量的影響 Western Blot結(jié)果見圖3。第7天，腦梗死后大鼠腦組織Bcl-2蛋白含量較假手術(shù)組降低，依達(dá)拉奉組較模型組Bcl-2蛋白含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組Bax蛋白含量升高；與模型組比較，依達(dá)拉奉組不同時間Bax蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表3。

a：假手術(shù)組；b：模型組第1天；c：模型組第3天；d：模型組第7天；e：依達(dá)拉奉組第1天；f：依達(dá)拉奉組第3天；g：依達(dá)拉奉組第7天。

項(xiàng)目組別只數(shù)第1天第3天第7天Bcl-2蛋白假手術(shù)組 31.07±0.060.95±0.081.13±0.10模型組 30.76±0.070.66±0.120.43±0.10依達(dá)拉奉組30.85±0.050.71±0.040.58±0.04①Bax蛋白假手術(shù)組 30.96±0.120.91±0.111.03±0.09模型組 31.62±0.111.90±0.122.24±0.14依達(dá)拉奉組31.06±0.13②1.48±0.08②1.76±0.15①

與模型組同時間比較，①P<0.05，②P<0.01。

2.4 依達(dá)拉奉對MCAO大鼠腦梗死急性期缺血半球Bcl-2 mRNA及Bax mRNA表達(dá)的影響 第1天、第3天，腦梗死后Bcl-2 mRNA表達(dá)無明顯變化，第7天升高；依達(dá)拉奉組各個時間Bcl-2 mRNA表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。腦梗死后Bax mRNA表達(dá)升高，依達(dá)拉奉可抑制Bax mRNA上升趨勢；與假手術(shù)組比較，依達(dá)拉奉組第1天和第7天Bax mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

項(xiàng)目組別只數(shù)第1天第3天第7天Bcl-2 mRNA假手術(shù)組 31.03±0.141.14±0.211.16±0.19模型組 30.99±0.141.10±0.161.73±0.43依達(dá)拉奉組31.87±0.24②2.14±0.22②3.08±0.55①Bax mRNA假手術(shù)組 30.46±0.050.55±0.080.45±0.07模型組 31.06±0.251.47±0.141.81±0.36依達(dá)拉奉組30.63±0.10①1.10±0.190.93±0.10①

與模型組同時間比較，①P<0.05，②P<0.01。

2.5 依達(dá)拉奉對MCAO大鼠腦梗死急性期缺血半球VEGF蛋白含量及mRNA表達(dá)的影響 Western Blot結(jié)果見圖4。第3天及第7天，依達(dá)拉奉組可阻滯大鼠腦梗死急性期VEGF水平進(jìn)行性下降的病理過程，VEGF mRNA表達(dá)高于模型組，詳見表5、表6。可見依達(dá)拉奉轉(zhuǎn)錄及翻譯水平抑制腦梗死造成VEGF降低，促進(jìn)新生血管生成，從而起到保護(hù)神經(jīng)元作用。

a：假手術(shù)組；b：模型組第1天；c：模型組第3天；d：模型組第7天；e：依達(dá)拉奉組第1天；f：依達(dá)拉奉組第3天；g：依達(dá)拉奉組第7天。

組別 只數(shù)第1天第3天第7天假手術(shù)組 31.01±0.050.98±0.071.07±0.04模型組 30.65±0.070.50±0.030.34±0.03依達(dá)拉奉組30.70±0.090.65±0.07①0.57±0.03②

與模型組同時間比較，①P<0.05，②P<0.01。

組別 只數(shù)第1天第3天第7天假手術(shù)組 30.35±0.020.37±0.040.34±0.07模型組 30.28±0.020.28±0.010.27±0.06依達(dá)拉奉組30.31±0.030.37±0.05①0.37±0.02①

與模型組同時間比較，①P<0.05。

3 討 論

腦細(xì)胞凋亡是腦梗死后細(xì)胞發(fā)生的重要病理過程，其受到多種基因及蛋白調(diào)節(jié)。Bcl-2家族是其中重要的一環(huán)[7]。Bcl-2家族包含多種進(jìn)化相對保守的蛋白，共同特征是具有Bcl-2同源域。通過調(diào)控線粒體外膜通透性調(diào)控凋亡。Bcl-2家族分為兩類，一類抑制凋亡，一類促進(jìn)凋亡[8]。其中抑制凋亡的以Bcl-2為代表，促進(jìn)凋亡的以Bax為代表。細(xì)胞凋亡程度由二者表達(dá)水平高低和比例決定[9-10]。

本研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉能改善MCAO大鼠腦梗死急性期神經(jīng)功能，與模型組比較，第7天，依達(dá)拉奉組梗死腦半球內(nèi)Bcl-2含量均高于模型組，Bax含量各個時間均低于模型組；依達(dá)拉奉組Bcl-2 mRNA各個時間均高于模型組，第1天和第7天Bax mRNA均低于模型組。結(jié)果與Western Blot相符。由此推測，腦梗死急性期依達(dá)拉奉通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax水平抑制細(xì)胞凋亡，從而改善大鼠神經(jīng)功能。

VEGF是一種由細(xì)胞分泌的信號蛋白，主要作用是促進(jìn)新生血管生成，對胚胎血管發(fā)育及后天新生血管至關(guān)重要[11]。在血供不足、組織缺氧情況下，VEGF幫助新生血管生成，重新恢復(fù)血液及氧氣供應(yīng)[12]。近年來，VEGF在腦梗死后發(fā)揮的作用引起廣泛重視，越來越多研究證實(shí)提高VEGF含量對腦梗死病人神經(jīng)功能恢復(fù)及預(yù)后至關(guān)重要[13-14]。提高VEGF表達(dá)的相關(guān)機(jī)制得到深入研究[15-16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉能提高大鼠腦梗死后缺血半球內(nèi)VEGF含量，梗死后第3天及第7天依達(dá)拉奉組VEGF水平均優(yōu)于模型組。因此，依達(dá)拉奉可促進(jìn)缺血半球新生血管生成，恢復(fù)血供，從而減少神經(jīng)元死亡，促進(jìn)神經(jīng)功能。

依達(dá)拉奉是一種臨床常用的治療腦梗死藥物，具有清除自由基作用，本研究發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉能在腦梗死急性期可抑制凋亡、促進(jìn)血管再生，從多種機(jī)制提高神經(jīng)功能。然而腦梗死后產(chǎn)生的多種自由基與凋亡、血管再生關(guān)系仍不明確，需進(jìn)一步深入研究。