葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白基因rs780094多態(tài)性與冠心病痰瘀互阻證的關(guān)系探討

龐 博，谷 春，吳 敏，武慶娟，鄧雅文，侯雪筠，葉紅蕾，楊忖卿，李 軍，劉貴建

葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白(glucokinase regulatory protein， GCKR)基因位于人類染色體2p23.3上，共有19個(gè)外顯子，全長(zhǎng)27 078 bp，編碼大小約為68 kD的蛋白質(zhì)。GCKR可與葡萄糖激酶(glucokinase， GCK)結(jié)合并抑制后者的活性，而GCK對(duì)于血糖調(diào)節(jié)十分重要[1-3]。GCKR基因上的一些多態(tài)性位點(diǎn)可以影響GCKR表達(dá)的高低，并通過(guò)調(diào)節(jié)GCK影響血漿葡萄糖濃度[4]。因此，GCKR可通過(guò)GCK對(duì)糖尿病的發(fā)生有一定作用，GCKR基因多態(tài)性也是發(fā)生糖尿病的遺傳因素之一[5-6]。

痰瘀互阻證實(shí)質(zhì)研究多集中在冠心病、胰島素抵抗、脂肪肝等疾病[7-8]。早期識(shí)別或防止痰證和瘀證互化互結(jié)，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和客觀化的角度理解痰瘀互阻等證候形成機(jī)制，對(duì)于冠心病的辨證施治十分重要。在冠心病病證結(jié)合辨證體系中，痰瘀互阻是其中重要證型之一，在臨床上準(zhǔn)確進(jìn)行辨證，并合理運(yùn)用痰瘀同治的方法，可使此類證型的冠心病病人獲得較好療效[9]。目前，與痰瘀互阻證型相關(guān)的客觀因素尚不完全清楚，其形成機(jī)制有待闡明。基于決策樹(shù)的識(shí)別模式研究發(fā)現(xiàn)，空腹血糖可能與冠心病痰瘀互阻證型關(guān)系密切[10]。因此，那些可能影響糖代謝的先天因素有可能和冠心病痰瘀互阻證型存在一定關(guān)聯(lián)性。本研究分析GCKR基因rs780094多態(tài)性與冠心病痰瘀互阻證的關(guān)系，探討其CC基因型較另兩個(gè)基因型是否的冠心病病人更易出現(xiàn)痰瘀互阻證型。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 連續(xù)納入2017年7月—2018年3月在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院心內(nèi)科就診的符合標(biāo)準(zhǔn)的冠心病病人206例，包括穩(wěn)定型勞力性心絞痛和不穩(wěn)定型心絞痛病人。冠心病穩(wěn)定型心絞痛診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2007年《慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南》。冠心病不穩(wěn)定心絞痛診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2011年ACCF/AHA《不穩(wěn)定性心絞痛和非ST段抬高性心肌梗死(NSTEMI)指南》，并具有以下其中一項(xiàng)者：①原有的穩(wěn)定型心絞痛性質(zhì)改變，即心絞痛頻繁發(fā)作、程度嚴(yán)重和持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)；②休息時(shí)心絞痛發(fā)作；③最近1個(gè)月內(nèi)新近發(fā)生的、輕微體力活動(dòng)亦可誘發(fā)的心絞痛。參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》進(jìn)行中醫(yī)辨證分型。痰濁主要證候包括：胸悶痛，痰多體胖，舌胖伴苔厚膩，大便黏膩，肢體沉重等。血瘀主要證候包括：胸固定性痛，舌質(zhì)紫黯或有瘀點(diǎn)、瘀斑，舌下靜脈紫黯，面色紫黯，身體出現(xiàn)瘀點(diǎn)或瘀斑等。根據(jù)辨證結(jié)果將病人分為痰瘀互阻及非痰瘀互阻證兩組。辨證過(guò)程由兩名心血管科專業(yè)醫(yī)師進(jìn)行，一致者可錄入，不一致時(shí)則需請(qǐng)上級(jí)醫(yī)師參與辨證分析。本研究經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)后進(jìn)行。將206例冠心病病人辨證分為痰瘀互阻證組(80例)與非痰瘀互阻證組(126例)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡35～85歲，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性心肌梗死；其他心臟先天疾病、瓣膜病、重度神經(jīng)官能癥等所致胸痛者；心功能為Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)者；心律失常引起的胸悶胸痛；腦梗死急性期；合并肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病；最近2周內(nèi)有急性感染者；合并其他較嚴(yán)重而必須治療者(如血液病、腫瘤等)；妊娠或哺乳期婦女。

1.3 觀察指標(biāo) 收集數(shù)據(jù)包括空腹血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、白蛋白(ALB) 等指標(biāo)(應(yīng)用全自動(dòng)生化儀Olympus AU5800測(cè)定)。

1.4 DNA提取及檢測(cè) 利用EDTA抗凝全血，用血液基因組DNA提取試劑盒(DP318， TIANGEN， China)進(jìn)行DNA提取，步驟依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。按自行設(shè)計(jì)的冠心病相關(guān)SNP panel進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，panel中含有rs780094目標(biāo)檢測(cè)位點(diǎn)，按照公司(iGeneTech，China)標(biāo)準(zhǔn)方式進(jìn)行預(yù)處理和測(cè)序分析。以100 ng的DNA樣品作為建庫(kù)的起始投入量。文庫(kù)構(gòu)建試劑盒使用MultipSeq?Custom Panel，每一個(gè)樣品使用不同的接頭，文庫(kù)構(gòu)建流程按照廠家說(shuō)明書進(jìn)行。首先進(jìn)行第一輪多重PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min 30 s，98 ℃變性20 s，60 ℃復(fù)性、延伸2 min，反應(yīng)20個(gè)循環(huán)，72 ℃預(yù)延伸5 min。獲得的PCR產(chǎn)物用AMPure XP磁珠純化。加入相應(yīng)的接頭序列進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 3 min 30 s，98 ℃變性20 s，58 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)10個(gè)循環(huán)，72 ℃預(yù)延伸5 min。獲得的PCR產(chǎn)物用AMPure XP磁珠純化。獲得的捕獲文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，用Qubit?3.0檢測(cè)文庫(kù)的濃度；用Agilent 2100 Bioanalyzer system進(jìn)行文庫(kù)片段長(zhǎng)度測(cè)定。合格文庫(kù)上機(jī)測(cè)序，用Illumina NextSeq 500測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，使用Fastp軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除低質(zhì)量堿基，去除引物序列，獲得clean reads，使用Bwa軟件將clean reads與GRCh37參考基因組進(jìn)行比對(duì)，去除重復(fù)序列，使用GATK軟件進(jìn)行SNV和InDel的檢測(cè)、注釋。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組病人在年齡、性別等一般情況方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，痰瘀互阻證組病人血糖稍高[6.09±2.36)mmol/L 與(5.98±2.13)mmol/L，P=0.574]，三酰甘油稍高于非痰瘀互阻證組，低密度脂蛋白稍低于非痰瘀互阻證組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，檢測(cè)的其他生化指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組GCKR基因rs780094分型比較 冠心病痰瘀互阻證組中，rs780094 CC基因型的比例高于非痰瘀互阻證組(28.75%與 14.29%P=0.013)，其等位基因C的比例也高于非痰瘀互阻證組( 53.75% 與 39.68%P=0.006)。在Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的中國(guó)北京漢族人rs780094 CC基因型的比例為14.6%，與本研究中非痰瘀互阻證組CC基因型的比例14.29%非常接近。詳見(jiàn)表2。

表2 兩組GCKR基因rs780094分型比較 單位：例(%)

2.3 GCKR基因rs780094不同遺傳模式與冠心病痰瘀互阻證之間的關(guān)系 在累加模型中，按照TT為0，TC為1，CC為2進(jìn)行賦值，將1和2為設(shè)置啞變量后，賦值為1與2的兩組分別與賦值最低的第一組進(jìn)行比較，Logistic回歸分析顯示，累加模型2中的結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=3.307， 95%CI(1.438，7.606)，P=0.005]，說(shuō)明CC與TT相比，與痰瘀互阻證存在顯著關(guān)聯(lián)(見(jiàn)表3)，而TC的關(guān)聯(lián)性則未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=1.618， 95%CI(0.815，3.209)，P=0.169]。此外，其顯性模型[OR=1.989， 95%CI(1.039，-3.805)，P=0.038]和隱性模型[OR=2.421， 95%CI(1.208，4.852)，P=0.013]也均具有顯著相關(guān)性。詳見(jiàn)表3。

表3 GCKR基因rs780094遺傳模式對(duì)冠心病痰瘀互阻證影響的Logistic回歸分析

3討 論

隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和人類基因組數(shù)據(jù)的積累，大量與疾病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism， SNP)數(shù)據(jù)不斷涌現(xiàn)，為未來(lái)的現(xiàn)代化個(gè)體化診療提供了可能。中醫(yī)證候及其要素符合中醫(yī)的整體觀，同樣具有鮮明的個(gè)體化特征，通過(guò)科學(xué)的方法將二者融匯，對(duì)中西醫(yī)結(jié)合發(fā)展非常有益。冠心病病人先天具有某類證候發(fā)展傾向性，有可能通過(guò)與SNP等大量基因數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)而獲得更好的理解。本研究將冠心病病人分為痰瘀互阻證與非痰瘀互阻證兩組，發(fā)現(xiàn)GCKR基因rs780094 CC基因型更多地分布于痰瘀互阻證組，提示rs780094 基因型可能與痰瘀互阻證型的形成具有一定關(guān)聯(lián)性。

痰瘀互阻屬于本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜的標(biāo)實(shí)證。機(jī)體陽(yáng)氣衰微、氣虛或情志不暢，氣機(jī)郁結(jié)，有失運(yùn)化，津液積聚，形成痰瘀，久之入絡(luò)，痰瘀交結(jié)[11]。按病證結(jié)合理論，痰瘀互阻型冠心病應(yīng)首先符合西醫(yī)冠心病診斷，除胸悶、胸痛外，同時(shí)多伴有體型肥胖，神疲乏力，煩躁失眠，咳嗽痰多，苔白或白膩，舌可有瘀斑，脈弦滑。可伴煩滿或抑郁，可有血糖、血脂或血壓的升高。《靈樞·百病始生》較早記載了痰瘀的概念，指出： “凝血蘊(yùn)里而不散，津液澀滲，著而不去，而積皆成矣。”元代朱丹溪?jiǎng)t提出“痰夾瘀血，遂成窠囊”，并提出痰瘀同治的方法。

既往已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，痰瘀互阻證的形成與血糖代謝異常的關(guān)系非常密切。從體質(zhì)方面來(lái)看，痰證多與肥胖或高體質(zhì)指數(shù)相關(guān)，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中也有“肥人多痰”的說(shuō)法。典型的痰證病人多嗜食肥甘厚膩，脾胃運(yùn)化不利，痰濁壅塞，痰濕內(nèi)蘊(yùn)。而肥胖多與胰島素抵抗、2型糖尿病等相關(guān)。有研究顯示，痰證與血糖、血胰島素、胰島素抵抗指數(shù)均呈正相關(guān)[12]。此外，瘀證也同樣與血糖代謝失調(diào)相關(guān)。血糖長(zhǎng)期過(guò)高導(dǎo)致對(duì)血管的毒性作用，微血管受損后出現(xiàn)通透性增加，伴有滲出、水腫，甚至出血，導(dǎo)致組織局部炎癥，代謝不暢，這些滲出及“離經(jīng)之血”都是形成瘀的病理基礎(chǔ)。病情長(zhǎng)期演化，痰瘀相互交結(jié)，形成痰瘀互阻證型。因此，血糖代謝異常被認(rèn)為是痰瘀互阻形成的因素之一[13]。本研究結(jié)果顯示，痰瘀互阻證組空腹血糖稍高于非痰瘀互阻證組，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與采集的樣本量較小以及樣本具體特征有關(guān)，同時(shí)也說(shuō)明血糖異常可能參與痰瘀互阻證型的形成，但并非唯一要素。

在血糖調(diào)節(jié)中，GCK是糖代謝的關(guān)鍵調(diào)控酶，它可以催化葡萄糖在肝細(xì)胞和胰腺β細(xì)胞中的磷酸化，同時(shí)可作為葡萄糖濃度的感受器，調(diào)節(jié)胰島素分泌以及肝糖原合成及糖異生過(guò)程。GCKR通過(guò)對(duì)GCK的特異性抑制，實(shí)現(xiàn)其對(duì)血糖穩(wěn)態(tài)重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，GCKR基因的兩個(gè)單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性rs780094和rs1260326存在高度連鎖不平衡并與其功能密切相關(guān)，后者堿基多態(tài)性發(fā)生的變化會(huì)導(dǎo)致氨基酸的改變，引起GCKR表達(dá)水平與活性的顯著變化，并使得GCK的亞細(xì)胞定位改變，使肝臟葡萄糖代謝出現(xiàn)變化，從而影響血糖水平[14]。已有較多的大樣本研究指出，rs780094的CC基因型與代謝綜合征及糖尿病發(fā)生率升高顯著相關(guān)。不僅如此，同時(shí)rs780094也與病人的多個(gè)其他表型或疾病相關(guān)，如血脂代謝、冠心病的發(fā)生、非酒精性脂肪肝、肝臟酶學(xué)變化以及超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)等[15-20]。盡管血糖和血脂檢測(cè)指標(biāo)在CC基因型上呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，但rs780094與多種疾病表型或檢驗(yàn)指標(biāo)之間的聯(lián)系仍值得深入研究。本研究結(jié)果顯示，rs780094的CC基因型與冠心病病人中的痰瘀互阻證關(guān)系密切，提示從基因?qū)用嫔辖馕鲋嗅t(yī)證候存在著一定的可能性。DNA水平的特征在一定程度上決定了病人的某些先天代謝特性，可能對(duì)決定個(gè)人體質(zhì)有重要作用，因此，對(duì)于某類證候發(fā)生的傾向性可能具有一定貢獻(xiàn)作用。rs780094的CC基因型與血糖代謝異常的內(nèi)在聯(lián)系可能對(duì)于痰瘀互阻形成具有一定作用，但仍不足以對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行全面的解釋，因此，GCKR rs780094單核苷酸多態(tài)性在除血糖外的其他方面影響痰瘀互阻形成的機(jī)制和具體分子機(jī)制同樣值得研究。

本研究存在以下幾點(diǎn)局限性：首先，盡管選用了標(biāo)準(zhǔn)化的病證結(jié)合辨證體系，但證候的判定仍具有一定的主觀性，在辨證體系中如能引入更多客觀指標(biāo)可能會(huì)進(jìn)一步減少主觀造成的偏差；其次，痰瘀互阻證的形成可能涉及多個(gè)相關(guān)基因、環(huán)境以及二者的相互作用，并非僅用血糖單一因素或GCKR基因的一個(gè)SNP就能得到解釋。未來(lái)結(jié)合多基因、多參數(shù)檢測(cè)指標(biāo)等大數(shù)據(jù)，有可能獲得更多的痰瘀互阻冠心病的客觀證據(jù)，并對(duì)其形成機(jī)制做出很好解釋，使中醫(yī)證候理論與更多客觀指標(biāo)相結(jié)合，并結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)得到更好的推廣、更科學(xué)有效的應(yīng)用。

本研究通過(guò)比較冠心病痰瘀互阻證組與非痰瘀互阻證組病人GCKR rs780094多態(tài)性的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠心病痰瘀互阻證型與rs780094多態(tài)性存在顯著關(guān)聯(lián)，這可能與rs780094對(duì)糖代謝的影響有關(guān)。因此，通過(guò)基因水平的研究，可能對(duì)于了解冠心病病人出現(xiàn)某種證候的傾向性有一定幫助，該研究結(jié)果應(yīng)當(dāng)在更大樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，并利用更多的基因數(shù)據(jù)對(duì)證候進(jìn)行研究，基于更客觀的證據(jù)完善病證結(jié)合體系，指導(dǎo)中西醫(yī)結(jié)合診療實(shí)踐。