急性心肌梗死病人血清miR-29b和miR-424的表達水平及其與預后的關系

劉志立，宋 菊，焦亞洲

急性心肌梗死是冠狀動脈急性或持續性缺血缺氧引起心肌缺血的一類冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，其主要特點為發病迅速、病情發展快及死亡率高等。近年來，我國急性心肌梗死的發病率逐漸升高，相關研究表明心肌細胞或心血管疾病的發生與炎性因子的異常表達有關，但關于炎性因子與上游基因的相關調節機制尚未明確[1]。近年來有關研究表明MicroRNAs(miRNAs)對心肌細胞的功能具有調節作用，在急性心肌梗死發病過程中可發揮纖維化與抗纖維化作用，且某些miRNAs可調控體內多種基因的表達[2]。還有研究表明miR-29b可抗心臟纖維化并改善心功能[3]。miR-424是長度為19～25 nt的一類內源性非編碼RNA，通過調控血管生成過程并參與多種疾病的發生發展而影響個體發育[4]。目前關于血清miR-29b與miR-424表達水平與急性心肌梗死相關性的研究相對較少，本研究探討急性心肌梗死病人血清miR-29b與miR-424表達水平及其與預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年12月—2015年5月我院收治的96例急性心肌梗死病人為研究組，另選取同期96名健康者為對照組。對照組，男47名，女49名，年齡49～72(60.24±7.65)歲。研究組，男46例，女50例，年齡50～75(61.14±9.23)歲，發病時間1～12(6.02±1.53)h。兩組研究對象的性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經我院倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準 納入標準：符合急性心肌梗死診斷的相關標準[5]；發病時間≤12 h者；受試人員知情且簽署知情同意書。排除標準：患有嚴重心肌病者；嚴重肝腎功能衰竭者；患有自身性免疫疾病者；近期有重大手術者。

1.3 檢測方法

1.3.1 儀器與試劑 miR-29b、miR-424及U6引物由廣州Invitrogen公司合成；RNA提取試劑盒訂購于北京生化科技有限公司；反轉錄試劑盒購于Thermo scientific公司，SYBR Green RCR masrer mix與Trizol選購于美國Invitrogen公司，熒光定量PCR儀購于ABI公司，NanoDrop 2000超微量核酸測定儀來自美國Thermo公司，試驗所用其他試劑均來自Takara公司。

1.3.2 血樣采集 急性心肌梗死病人于入院后采集外

周靜脈血5 mL，采集對照組外周靜脈血5 mL，室溫下靜置30 min，離心10 min，放置超低溫冰箱保存。

1.3.3 檢測miR-29b與miR-424表達水平 提取總RNA：200 μL血清樣本加入400 μL Trizol，按照Trizol法提取組織總RNA，核酸測定儀測定RNA純度與含量，取2 μg采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。miR-29b：上游(Forward primer，正向引物)ACGCGTCACCGAAGGTCTAAGCATTT；下游(Reversed primer，反向引物)AGATCTTGCCGTGACAGTTCAGTAGG。以U6作為內參基因，上游：CTGGTA GGG TGCT CGCT TCGGCAG，下游：CA ACTGGTGTAGTGGAGTCGGC。miR-424引物：上游：CGAAG CAGCAGCAATTCATG；下游：GTGCAGGGTCCGAGGT。實時定量PCR檢測的反應體系共20 μL，SYBR Green Mix 10 μL，Forward-Primer 2.0 μL，Reverse-Primer 2.0 μL，cDNA 2.0 μL，R Nase-free dd H2O 4.0 μL，反應均設置3個生物學重復，反應條件為95 ℃ 預變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 1 s，45個循環；72 ℃延伸10 min，反應均以U6為內參計算miR-29b與miR-424的相對表達量，采用2-ΔΔCt算法計算基因相對表達量。

1.3.4 檢測炎性因子含量 第一天清晨空腹采集兩組研究對象的外周靜脈血4 mL，置于抗凝管中，轉速為2 000 r/min，離心10 min后取血漿，-80 ℃保存，采用酶聯免疫吸附法，并選用美國Ray Biotech公司生產的試劑盒測定血清中超敏C-反應蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與白細胞介素-6(IL-6)含量，酶聯免疫吸附試劑盒選購于美國Ray Biotech公司。

1.4 隨訪 采用打電話、門診復查等方式隨訪3年，記錄病人有無生存進展期(progression free survival，PFS)情況。

2 結 果

2.1 兩組血清中miR-29b、miR-42表達量比較 研究組血清中miR-29b表達量低于對照組，而miR-424表達量高于對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組血清中miR-29b與miR-424表達量比較(±s) 單位：U6

2.2 兩組血清中炎性因子含量比較 研究組血清中hs-CRP、TNF-α及IL-6含量高于對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組血清中炎性因子含量比較(±s)

2.3 研究組病人血清中miR-29b、miR-424表達與炎性因子的關系 miR-29b表達與TNF-α呈正相關(P<0.05)，而與hs-CRP及IL-6表達水平無明顯相關關系(P>0.05)。詳見圖1。miR-424與hs-CRP、IL-6的表達呈負相關，差異均具有統計學意義(P<0.05)，而與TNF-α無明顯相關性(P>0.05)。詳見圖2、圖3。

圖1 miR-29b表達與TNF-α表達水平的相關性

圖2 miR-424表達與hs-CRP表達水平的相關性

圖3 miR-424表達與IL-6表達水平的相關性

2.4 研究組病人血清中miR-29b與miR-424表達的關系 利用Pearson檢驗急性心肌梗死病人血清中miR-29b與miR-424表達的相關性，結果顯示miR-29b與miR-424呈負相關(P<0.05)。詳見圖4。

圖4 miR-29b與miR-424 mRNA表達的相關性

2.5 研究組病人血清中miR-29b及miR-424表達水平與預后的關系 隨訪3年后，將病人的生存進展情況繪制Kaplan-Meier曲線圖。miR-29b表達中位值為(0.21±0.04)U6，低于中位值為低表達，高于中位值為高表達，miR-29b低表達者PFS比例(47.23%)高于高表達者(21.41%)。miR-424表達量的中位值為(0.76±0.13)U6，低于中位值為低表達，高于中位值為高表達，miR-424高表達者PFS比例(42.15%)高于低表達者(15.21%)，差異均具有統計學意義(P<0.05)。詳見圖5、圖6。將急性心肌梗死病人在隨訪期間的死亡結局與病人性別、年齡、血清中miR-29b與miR-424表達水平等指標進行Cox多元素回歸分析，結果顯示血清中miR-29b與miR-424表達均是急性心肌梗死病人死亡的危險因素。詳見表3。

圖5 miR-29b表達水平與PFS的關系

圖6 miR-424表達水平與PFS的關系

表3 血清miR-29b、miR-424表達與病人死亡的多元回歸分析

3 討 論

急性心肌梗死是由于炎癥加重、血小板活化等引起斑塊破裂形成血栓并阻塞管腔造成心肌缺血而促使病人發病[6]。急性心肌梗死具有發病率高等特點，而體內炎性因子表達異常會損傷心肌細胞，研究證實血清中hs-CRP表達水平不僅可預測機體炎癥反應，同時為心血管疾病的獨立危險因子[7]。Niu等[8]研究表明TNF-α的含量升高能夠損傷血管內皮，且與血管內皮細胞一氧化氮(NO)合成酶活性有關，而NO合成會引起血管舒張。血清中IL-6不僅參與免疫反應的細胞增殖、分化，還可與受體IL-6R結合增強巨噬細胞的功能而引起血管內皮細胞損傷[9]。雖然上述炎性因子與急性心肌梗死的發病有密切關系，但其中具體的作用機制尚未完全闡明[10]。miRNAs是真核生物中廣泛存在的一種核苷酸RNA分子，可與其他蛋白結合并促進靶基因的降解或沉默而達到調控相關基因表達的目的，且參與體內多種生物學過程，研究表明心肌細胞中某些miRNAs可通過與靶mRNAs的3′UTR互補配對而調節炎性因子的表達，此外，血液循環中由心肌細胞釋放miRNAs的含量變化與血清中miRNAs的含量變化相關[11]。因此，探討血清中miRNAs表達水平對急性心肌梗死的診療及其具體機制的研究具有重要意義。

miR-29b屬于miR-29家族，研究顯示miR-29b可促使血小板衍生因子、血管內皮生長因子等轉移而引發不同疾病[12]。Wang等[13]研究表明miR-29b通過與PA200依賴性蛋白激酶反應導致心血管內皮功能發生障礙。有研究發現miR-29b表達與血管平滑肌細胞由醛固酮介導的血管發病機制有關[14]。本研究通過實時熒光定量PCR法檢測研究組急性心肌梗死病人與對照組健康受試人員血清中miR-29b的表達水平，結果顯示研究組血清miR-29b的表達水平低于對照組，而病人血清中hs-CRP、TNF-α及IL-6水平均高于對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。根據miR-29b表達量的中位值將其分為高表達與低表達組，觀察miR-29b表達量與血清中hs-CRP、TNF-α及IL-6表達水平的相關性，結果顯示miR-29b的高表達、低表達均與TNF-α呈正相關(P<0.05)，而與其他兩個炎性因子的相關性不顯著(P>0.05)，說明血清中miR-29b可通過調節TNF-α表達水平而發揮一定作用，推測血清中miR-29b的表達水平可反映急性心肌梗死診斷與監測指標。

miR-424屬miR-16家族，位于X染色體，研究表明miR-424不僅與腫瘤細胞的生長相關，還可調節血管生成與細胞遷移等[15]。miR-424與單核細胞及巨噬細胞的分化有關，可促進單核細胞與巨噬細胞分化并參與動脈粥樣硬化的形成發展過程[16]。此外，許多研究表明miR-424可參與多種個體發育與疾病的發展進程，可通過提高絲裂原活化蛋白激酶1與細胞周期蛋白E1表達而形成異常血管[17]。文獻報道miR-424可通過靶向血管生長因子、調控蛋白cyclinD1、抑制血管內皮細胞增殖，同時miR-424表達降低可促使cyclinE1的表達增加從而形成異常血管[18]。最新研究表明miR-424可促進細胞增殖并抑制細胞遷移，當心臟發生心肌缺血時miR-424則在心肌細胞中呈上調表達，從而促進新生血管的形成[19]。本研究通過實時熒光定量PCR法檢測研究組與對照組血清中miR-424的表達水平，結果顯示研究組血清miR-424的表達水平高于對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。根據miR-424表達量的中位值將其分為高表達組與低表達組，觀察miR-424表達量與血清中hs -CRP、TNF-α及IL-6表達水平的相關性，結果顯示miR-424的高、低表達均與hs-CRP、IL-6呈負相關(P<0.05)，而TNF-α的相關性不顯著(P>0.05)，說明miR-424表達水平升高可通過降低血清中hs-CRP與IL-6表達而發揮作用。同時本研究對miR-29b與miR-424的相關性進行分析，結果顯示miR-29b與miR-424呈負相關(P<0.05)，通過對急性心肌梗死病人隨訪3年后的死亡數量與miR-29b及miR-424表達量進行多元回歸分析，結果顯示miR-29b與miR-424均是其危險因素。本研究結果揭示了血清中miR-29b與miR-424的異常表達可能導致血清中炎性因子水平升高，并促使體內發生炎癥反應，從而嚴重損傷血管內皮細胞，造成心肌缺血進一步促使急性心肌梗死的發生，miR-29b及miR-424與急性心肌梗死的病情發展及其預后密切相關，且均是急性心肌梗死病人死亡的危險因素。

綜上所述，血清中miR-29b與miR-424的表達水平是否異常與診療急性心肌梗死及其預后密切相關，推測可作為預測篩查與監測急性心肌梗死的指標。但本研究存在一定的不足，由于多因素調節急性心肌梗死且發病機制較復雜，miR-29b與miR-424的表達水平能否適合作為急性心肌梗死篩查的監測標志物還有待進一步研究。