四神丸中3 種成分在正常大鼠及抑郁大鼠體內藥動學的比較

孫 紅，宋珊珊，井 汶，張 優，谷 雨，居文政

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京210029）

抑郁癥具有高發病、高自殺、高復發和低識別、低就診、低治療等特點，已成為21 世紀最主要的精神疾病，據WHO 統計，全球抑郁癥患者達12.8%，預計2030 年將成為僅次于心血管疾病的第二大疾病［1-2］，我國患病率高達6.1%［3］。目前，抗抑郁西藥以單胺類抑制劑為主［4］，但這些藥物起效慢，不良反應明顯，而且30%～50%的患者不敏感。近年來，中醫藥在防治抑郁癥上獲得較好的臨床療效。

四神丸出自 《證治準繩》，由肉豆蔻、補骨脂、五味子、吳茱萸、大棗等藥材組成［5］，具有溫補脾腎的功能，組方加減后用于治療脾腎陽虛患者有一定療效［6］。原發性抑郁、內源性抑郁、惡劣心境中的抑郁情緒在本質上“屬虛”，五臟陽氣不足是其病理基礎［7］，根據中醫郁證病機中“陽虛致郁” 的理論［8-9］，四神丸可改善脾腎陽虛所致的抑郁狀態，動物實驗表明［10-14］，方中補骨脂和五味子中主要成分補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲具有抗抑郁作用，但作用機理尚不明確，雖然已有方中補骨脂素、異補骨脂素在正常大鼠中的藥動學研究［15］，但尚未見在抑郁大鼠中的相關報道。因此，本實驗將比較四神丸中上述3 種成分在正常大鼠和抑郁大鼠體內的藥動學，探索其作用機理。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀，配置API 4000 LC-MS／MS 三重四級桿質譜儀 （美國Agilent 公 司）；MS105 電子天 平 （瑞 士Mettler-Toledo 公司）；Centrifuge-5417R 冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；Advantage A10 超純水機（法國Millipore 公司）；MIX-25P 旋渦混合儀（杭州米歐儀器有限公司）；Labconco 離心濃縮儀 （美國Labconco 公司）；RE-52CS 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試劑與藥物 肉豆蔻（煨） （批號171001）、補骨脂（鹽炒） （批號180404006）、五味子（醋制） （批號170513001）、吳茱萸（制） （批號160623）、大棗（去核） （批號170520001） 均購于北京同仁堂南京藥店，經江蘇省中醫院藥學部副主任中藥師張倩鑒定為正品，符合《中國藥典》標準。對照品補骨脂素（批號17092820）、異補骨脂素 （批 號18062910）、五味子醇甲 （批 號17021905） 均購于成都曼思特生物科技有限公司，純度均≥98.5%；替硝唑 （批號100126-200402）購于中國食品藥品檢定研究院，純度≥95%。四神丸根據2015 年版《中國藥典》 處方自制，補骨脂、肉豆蔻、五味子、吳茱萸、大棗比例為4 ∶2 ∶2 ∶1 ∶2，上述藥材用10 倍量75% 乙醇浸泡30 min，回流提取2 h，濾渣再加8 倍量75%乙醇回流提取1 h，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，-20 ℃下保存，1 100 g 藥材濃縮至785 mL，即每1 mL 藥液含1.4 g 原藥材（分別含補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲1.60、1.36、0.65 mg）。甲醇、乙腈購自德國Merck 公司；水為超純水。

1.3 動物 SD 大鼠，雄性，12 只，體質量（190±10）g，由南通大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK （蘇） 2019-0001。實驗前大鼠適應性飼養1 周，保持12 h 晝夜節律，室溫（22±2） ℃，自由攝食飲水。

2 方法與結果

2.1 色譜、質譜條件 ACE Excel 3 C18-PFP 色譜柱（100 mm×3.0 mm）；流動相乙腈-0.1% 甲酸（36 ∶64）；體積流量500 μL／min；柱溫40 ℃；離子源ESI+，多反應檢測模式（MRM）；離子源電壓4 000 V；離子源溫度400 ℃。質譜參數見表1。

表1 各成分質譜參數Tab.1 MS parameters for various constituents

2.2 溶液制備 精密稱取補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲對照品適量，甲醇分別溶解定容至2.07、2.14、2.00 mg／mL，以此為母液，臨用前稀釋。再精密稱取替硝唑適量，配制成100 ng／mL內標液。

2.3 血漿樣品處理 取100 μL 空白血漿，加入10 μL 內標溶液，渦旋混勻30 s，加入800 μL 乙酸乙酯，振蕩3 min，12 000 r／min 離心10 min，取700 μL 上清液，40 ℃下離心濃縮，加入100 μL 50%乙腈復溶，振蕩3 min，12 000 r／min 離心10 min，取5 μL 上清液進樣分析。

2.4 造模及血漿樣品采集 大鼠按體質量均衡和隨機的原則分為正常組和模型組，每組6 只，正常組每籠3 只，模型組單籠飼養，并在21 d 內接受10 種刺激因子，包括禁食、禁水、潮濕墊料、晝夜顛倒、閃光、4 ℃冰水游泳、熱刺激5 min、束縛應激6 h、水平振蕩10 min、觸摸陌生異常物品。確認造模成功后，第22 天大鼠禁食不禁水12 h，灌胃給 予四神 丸混懸 液 6.48 g／kg （即4.63 mL／kg），于給藥前及給藥后5、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480、720、960、1 440 min眼眶取血各約0.3 mL，置于肝素化EP 管中，4 000 r／min 離心10 min，取上層血漿保存于-80 ℃冰箱中待測。

2.5 行為學實驗 在造模3 周后開始。

2.5.1 糖水消耗實驗 大鼠在適應性期間給予2瓶2%蔗糖溶液適應3 d 后，才進行實驗。大鼠禁水18 h，每只給予體積相同的1 瓶2%蔗糖溶液和1 瓶純水，測試4 h，其中每2 h 2 瓶水交換位置。實驗結束后，計算糖水消耗率，公式為糖水消耗率＝ ［（蔗糖消耗量） ／ （純水消耗量+蔗糖消耗量）］ ×100%。

2.5.2 曠場實驗 實驗前需提前將大鼠搬入測試室使其適應環境1 h，再放入長、寬、高均為50 cm，內壁涂黑的紙箱中心，底面平均分為25個10 cm×10 cm 的小方格。以5 min 內大鼠三爪以上穿越底面的方格數為水平得分，穿越1 格得1 分；以大鼠雙前肢抬起1 cm 以上次數為垂直得分，離地一次得1 分。實驗過程進行攝像和計時。

2.5.3 強迫游泳實驗 正式實驗前1 d 大鼠進行預游泳，將其放入（24±2）℃水中并保持懸浮，四肢不能觸及桶底，15 min 后取出，擦干放回籠中，整個實驗過程保持安靜。次日在相同條件下大鼠強迫游泳5 min，記錄后4 min 內不動時間（大鼠僅有頭部露出水面，呈漂浮狀態，四肢可有微動）。

2.5.4 結果分析 經過21 d 造模后，與正常組比較，模型組大鼠糖水消耗率、水平得分、豎直得分降低 （P＜0.05，P＜0.01），不動時 間延長（P＜0.05），顯示造模成功，見表2。

表2 各組大鼠行為學實驗結果（， n＝6）Tab.2 Results of behavioral tests for rats in various groups （， n＝6）

表2 各組大鼠行為學實驗結果（， n＝6）Tab.2 Results of behavioral tests for rats in various groups （， n＝6）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性考察 取空白大鼠血漿、空白大鼠血漿+對照品+內標（替硝唑）、給藥1 h 后血漿樣品，按“2.3” 項下方法處理，在“2.1” 項條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲、內標（替硝唑） 保留時間分別為4.72、5.24、7.34、1.5 min，各成分與內標色譜峰峰形良好而且互不干擾，同時血漿中雜峰也無干擾，基線平穩，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分LC-MS／MS 色譜圖Fig.1 LC-MS／MS chromatograms of various constituents

2.6.2 線性關系考察 取100 μL 空白大鼠血漿，加入對照品、內標溶液各10 μL，按“2.3” 項下方法處理，在“2.1” 項條件下進樣測定。以各成分峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標（Y），溶液質量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，以S／N≥10為最低定量限，結果見表3，可知各成分在各組范圍內線性關系良好。

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.6.3 準確度、精密度試驗 取100 μL 空白大鼠血漿，制成低、中、高3 個質量濃度的樣品（補骨脂素3.2、80、1 200 ng／mL，異補骨脂素1.6、40、600 ng／mL，五味子醇甲0.32、8、120 ng／mL），按“2.3” 項下方法處理，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，連續3 d，結果見表4，可知該方法準確度、精密度良好。

表4 各成分準確度、精密度、基質效應試驗結果Tab.4 Results of accuracy，precision and matrix effect tests for various constituents

2.6.4 基質效應試驗 精密加入低、中、高質量濃度對照品溶液及內標溶液各10 μL，復溶到80 μL，振蕩3 min，12 000 r／min 離心10 min，取上清液5 μL，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，峰面積為A1；按“2.3” 項下方法提取空白血漿（不加內標），離心濃縮后同法操作，峰面積為A2，計算基質效應，公式為基質效應＝A2／A1×100%，結果見表4，可知內源性物質對3 種成分無影響。

2.6.5 穩定性試驗 取100 μL 空白大鼠血漿，按“2.6.3” 項下方法制成低、中、高3 個質量濃度的樣品各3 份，分別在室溫下放置12 h、-20 ℃下反復凍融3 次、-80 ℃下保存30 d 后，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。結果，補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲峰面積RSD 分別為0.99%～5.16%、1.09%～4.78%、0.90%～4.24%，表明該方法穩定性良好，符合生物樣品分析要求。

2.6.6 提取回收率 取100 μL 空白大鼠血漿，按“2.6.3” 項下方法制成低、中、高3 個質量濃度的質控樣品，各5 份，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，峰面積為A3，計算提取回收率，公式為提取回收率＝A3／A2×100%。結果，補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲提取回收率分別為66.33%～70.28%、61.28%～74.45%、61.93%～68.16%。

2.7 藥動學研究 各成分在正常大鼠、抑郁大鼠體內的血藥濃度-時間曲線見圖2，經DAS1.0 軟件處理分析后主要藥動學參數見表5。由此可知，各成分藥動學均符合一室模型；與正常組比較，模型組各成分Cmax、AUC0～t升高（P＜0.05，P＜0.01），以異補骨脂素更明顯。

圖2 各成分血藥濃度-時間曲線Fig.2 Plasma concentration-time curves for various constituents

表5 各成分主要藥動學參數（， n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for vairous constituents （， n＝6）

表5 各成分主要藥動學參數（， n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for vairous constituents （， n＝6）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3 討論

本實驗在測定大鼠血漿中補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲含有量時發現，補骨脂素、異補骨脂素是同分異構體，質荷比相同，質譜無法區分，故應用液相色譜將兩者分離開。在考察流動相時發現，乙腈作為有機相峰形和出峰時間較好，而0.1%甲酸作為水相同分異構體峰形良好。再通過考察不同型號和品牌色譜柱，確定ACE Excel 3 C18-PFP色譜柱（100 mm×3.0 mm） 能滿足分析要求。

在血漿樣本處理過程中，本實驗考察了蛋白沉淀（甲醇、乙腈、10% 三氯乙酸） 和液液萃取（乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷），發現甲醇、乙腈蛋白沉淀的提取回收率與乙酸乙酯萃取的相近，且后者萃取后能明顯減少血漿樣本內源性物質干擾，提高基質效應，故選擇乙酸乙酯萃取作為前處理方法。

不同文獻報道的補骨脂素、異補骨脂素藥動學參數并不一致［15］，其原因可能是本實驗采用75%乙醇作為提取溶劑，而文獻采用水煎煮法，提取出來成分相差較大，給藥劑量也有所差異。與正常組大鼠比較，模型組補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲t1／2無明顯差異；異補骨脂素、五味子醇甲Tmax無明顯差異，而補骨脂素Tmax高于正常組；3種成分在抑郁大鼠體內的Cmax分別為在正常大鼠體內的1.36、1.30、1.47 倍，AUC0～t分別為1.38、1.27、1.40 倍，AUC0～∞分別為1.38、1.26、1.33倍，表明各成分吸收程度在抑郁大鼠體內明顯提高，而消除速度無明顯變化，其原因可能是疾病狀態導致其吸收過程發生改變［16-17］。綜上所述，大鼠在抑郁狀態下四神丸中補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲血藥濃度明顯改變，對臨床上抑郁癥患者用藥量具有一定參考意義。