魚鰾質量標準的提升

段秀俊，劉 培，楊 超，孫銘憶，何娟娟，范姣姣，段青青

（山西中醫藥大學，山西 晉中030619）

魚鰾又名魚白、魚脬、魚肚，為石首魚科動物大黃魚Pseudosciaena crocea（Richardson）、小黃魚Pseudosciaena polyactisBleeker，或鱘科動物中華鱘Acipenser sinensisGray、鰉魚Huso dauricus（Georgi）等魚鰾［1-2］，其藥用始載于《本草拾遺》［3］，性平味甘，歸腎經，具有補腎益精、滋養筋脈、止血、散瘀、消腫之功效，用于腎虛滑精、產后風痙、破傷風、吐血、血崩、創傷出血、痔瘡等［2］。它不僅是一味具有滋補作用的中藥，而且食用歷史悠久，《齊民要術》 中就有加工食用石首魚鰾（黃花魚一類） 的記載，唐代已被列為貢品，明代開始在民間普遍食用［4］，其富有膠質，與燕窩、魚翅齊名，為 “ 海洋八 珍” 之 一，譽 之 “ 海 洋人參”［5］。

目前，魚鰾被山西、山東、湖南等地藥材標準所收載，但缺少顯微鑒別及基于色譜分析的含有量測定［2，6-8］，溫俊達等［9］曾作過相應考察，但也未涉及上述項目。因此，本實驗對魚鰾質量標準進行了較系統的研究，鑒別項目包括性狀、顯微、TLC，檢查項目包括水分、總灰分、酸不溶性灰分，含有量測定包括總氮、17 種常見氨基酸，以期為該藥材現有質量標準提升，以及市場質量監控提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器 101A-1 型電熱鼓風干燥箱（上海申光儀器儀表有限公司）；SX2-4-10 型馬弗爐（上海亞明熱處理設備有限公司）；EL204 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-2 型數顯恒溫水浴鍋（金壇市榮華儀器制造有限公司）；BX53 型正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；DN-04C 型凱氏定氮儀（浙江托普儀器有限公司）；L-8900 型氨基酸自動分析儀（日本Hitachi 公司）；25 mL 酸式滴定管；定量濾紙（杭州沃華濾紙有限公司）；定性濾紙（杭州特種紙業有限公司）；微量進樣器（上海高鴿工貿有限公司）。

1.2 試劑與藥物 精氨酸對照品（批號110872-201207，中國食品藥品檢定研究院）；氨基酸混合物對照品［批號KPP5222，含天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸 （Ser）、谷氨酸 （Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸 （Ala）、半胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、絡氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg） 17 種常規蛋白水解液層析純氨基酸，每種濃度為2.50 μmol／mL］、茚三酮溶液（批號KQF6365）、茚三酮緩沖液 （批號KQF6365）（日 本 Wako 公 司）；流動相 PH-1 （批 號A5259H1）、PH-2 （批號A5259H2）、PH-3 （批號A5259H3）、PH-4 （批號A5259H4）、PH-RG （批號A5259RG）。硅膠薄層板（青島海洋化工廠分廠，煙臺芝罘黃務硅膠試驗廠）。魚鰾共11 批，經山西中醫藥大學裴香萍副教授鑒定為正品，信息見表1。鹽酸、氫氧化鈉為分析純；液氮純度大于99.99%；水為娃哈哈純凈水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 鑒別

2.1.1 性狀 本品呈長圓形薄片或紡綞形筒狀或小方塊狀，黃白色、淡黃色或黃棕色，角質樣，略有光澤，半透明；質堅韌，不易撕裂，裂斷處呈纖維性，氣微腥，味淡。本實驗比較了海魚、河魚魚鰾的性狀區別，主要體現在形狀、大小、顏色等方面，見表2、圖1。

2.1.2 顯微 200 倍顯微鏡下，能明顯觀察到魚鰾粉末中蛋白、平滑肌纖維，見圖2。其中，蛋白呈球形或類球形，有的聚集成團，有的單個散在，多數具有凹陷或裂隙；平滑肌纖維常單個存在，有的成束成層存在，單個纖維多呈長條形，無橫紋，常扭曲，長短不一，有的表面光滑，有的肌膜向下凹陷形成數量眾多的小凹，有的表面帶有毛刺。

表2 2 種魚鰾性狀區別Tab.2 Differences of characteristics between two kinds of fish maws

圖1 2 種魚鰾顏色和形狀Fig.1 Colors and shapes of two kinds of fish maws

圖2 魚鰾顯微特征（×200）Fig.2 Microscopic features of fish maws （×200）

2.1.3 TLC 參考文獻［9］ 報道。取本品粉末0.1 g，加50 mL 稀鹽酸加熱回流2 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加5 mL 70%乙醇溶解，作為供試品溶液；另取精氨酸對照品，加70%乙醇制成每1 mL含0.25 mg 該成分的溶液，作為對照品溶液。按照2015 年版《中國藥典》 四部0502 薄層色譜法，吸取上述溶液各1 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4 ∶1 ∶1） 為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%茚三酮丙酮溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，結果見圖3。由此可知，供試品色譜在對照品相應位置上顯示相同顏色斑點。

圖3 魚鰾TLC 色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of fish maws

2.2 檢查

2.2.1 水分 根據2015 年版《中國藥典》 四部0832 水分測定法第二法（烘干法） 進行測定，結果見表3。

表3 水分、總灰分、酸不溶性灰分、總氮含有量測定結果（n＝2）Tab.3 Results of content determination of water，total ash，acid-insoluble ash and total nitrogen （n＝2）

2.2.2 總灰分 根據2015 年版《中國藥典》 四部2302 灰分測定法進行測定，結果見表3。

2.2.3 酸不溶性灰分 根據2015 年版《中國藥典》 四部2302 灰分測定法進行測定，結果見表3。

2.3 含有量測定

2.3.1 總氮 根據2015 年版《中國藥典》 四部0704 氮測定法進行測定，結果見表3。

2.3.2 氨基酸

2.3.2.1 色譜條件 參考文獻［10-16］ 報道。分離柱為離子交換樹脂2622 柱（4.6 mm×60 mm），反應柱為離子交換樹脂2619 柱 （4.6 mm ×60 mm），除氨柱 為離子 交換樹 脂 2650 柱（4.6 mm×40 mm）；分離柱流動相為B1～B4 （分別為pH 值1、2、3、4 的檸檬酸鈉緩沖液），反應柱流動相為R1～R3 （為茚三酮溶液及其緩沖液），氨過濾柱流動相為B5～B6 （B5 為純水，B6 為PHRG 緩沖液），梯度洗脫，程序見表4；分離柱柱溫57 ℃，反應柱柱溫135 ℃；分離柱體積流量0.400 mL／min，反應柱體積流量0.350 mL／min；雙波長檢測，VIS 1 檢測除脯氨酸以外的氨基酸，波長570 nm，而VIS 2 檢測脯氨酸，波長440 nm。進樣量20 μL。在此條件下，17 種氨基酸分離效果均良好，見圖4。

表4 梯度洗脫程序Tab.4 Gradient elution programs

2.3.2.2 對照品溶液制備 吸取40 μL 氨基酸混合物對照 品母液 （2.50 μmol／mL），加960 μL 0.02 mol／L 鹽酸定容至1 000 μL，混 勻，即 得（0.10 μmol／mL），測定前經0.45 μm 微孔濾膜過濾。

圖4 各氨基酸色譜圖Fig.4 Chromatograms of various amino acids

2.3.2.3 供試品溶液制備 魚鰾粉碎后過5 號篩，精密稱取0.04 g 于25 mL 水解管中，加入10 mL 6.00 mol／L 鹽酸，充氮氣15 min 后封管，110 ℃水解24 h。取出冷卻，濾過，精密吸取濾液5 mL 于25 mL 三角瓶中，6.00 mol／L NaOH 溶液調pH 至7.0，將其轉移到25 mL 量瓶中，純凈水定容至刻度，精密吸取2.5 mL 于5 mL 量瓶中，0.02 mol／L鹽酸定容至刻度，搖勻，即得，測定前經0.45 μm微孔濾膜過濾。

2.3.2.4 線性關系考察 精密吸取 “2.3.2.2”項下對照品溶液80 μL，加920 μL 0.02 mol／L 鹽酸混勻，依次2 倍稀釋成0.10、0.05、0.025、0.012 5 μmol／mL，在“2.3.2.1” 項色譜條件下進樣20 μL 測定。以溶液濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表5，可知17種氨基酸在0.012 5～0.20 μmol／mL 范圍內均呈良好的線性關系。

表5 各氨基酸線性關系Tab.5 Linear relationships of various amino acids

2.3.2.5 精密度試驗 吸取0.10 μmol／mL 氨基酸混合物對照品溶液20 μL，在“2.3.2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 峰面積RSD 分別 為0.15%、0.11%、0.17%、0.15%、0.52%、0.24%、0.26%、0.22%、0.28%、0.30%、0.15%、0.12%、0.26%、0.25%、0.23%、0.21%、0.26%，表明儀器精密度良好。

2.3.2.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液（批號20140310），于 0、2、4、6、8、10 h 在“2.3.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 峰面積RSD分別為0.62%、0.91%、0.82%、0.52%、1.04%、0.31%、0.43%、0.41%、0.56%、1.06%、0.80%、0.66%、1.27%、0.50%、0.42%、0.71%、0.43%，表明供試品溶液在10 h 穩定性良好。

2.3.2.7 重復性試驗 取同一批藥材 （批號20140310），按“2.3.2.3” 項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 含有量RSD 分別為0.81%、1.58%、0.74%、0.79%、1.08%、0.44%、1.02%、2.43%、0.23%、1.83%、0.45%、0.59%、2.09%、1.07%、0.19%、0.93%、0.29%，表明該方法重復性良好。

2.3.2.8 加樣回收率試驗 取17 種氨基酸含有量已知的藥材（批號20140310） 6 份，每份約0.02 g，精密稱定，加入適量對照品溶液，按“2.3.2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 平均加樣回收率分別 為 99.37%、99.33%、98.77%、98.75%、98.07%、100.4%、99.65%、99.87%、101.7%、97.80%、98.95%、99.03%、98.25%、99.23%、100.7%、101.5%、99.78%，RSD 分別為2.26%、2.44%、2.39%、2.29%、2.41%、2.02%、2.31%、2.35%、2.39%、2.09%、2.39%、2.02%、2.29%、2.26%、2.34%、2.34%、2.50%。

2.3.2.9 樣品含有量測定 取11 批藥材，每批2份，每份約0.04 g，精密稱定，按“2.3.2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表6。

表6 各氨基酸含有量測定結果（mg／g， n＝2）Tab.6 Results of content determination of various amino acids （mg／g， n＝2）

3 討論

目前，市場上常見海魚魚鰾，而鮮有河魚魚鰾。本實驗除購買了1 批河魚魚鰾外，還曾另外購買了一些人工養殖大黃魚及小黃魚，將其解剖取魚鰾，干燥后進行觀察，但畢竟數量有限，其性狀特征是否具有市場代表性還有待進一步探討。

文獻［9，17］ 報道，藥材中提取氨基酸的方法大多為70%乙醇直接提取，但本實驗發現采用該方法制備的魚鰾供試品溶液在TLC 上始終無斑點呈現，后經酸水解處理后才清晰顯現，表明魚鰾中蛋白質含有量較高，而游離氨基酸較低。另外，TLC 鑒別時起初以丙氨酸為對照品，但在不同展開系統中斑點對齊情況并不理想，故又比對了9 種常見、價格適中氨基酸（亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、組氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、纈氨酸、精氨酸） 與魚鰾的薄層層析行為，發現精氨酸斑點重復性、對齊性最佳，故選擇其作為對照品。

本實驗首次考察了魚鰾顯微特征，但相對于組織結構明顯的藥材，魚鰾顯微特征很難考察。經反復實驗、查閱書籍、與生物化學及病理專家交流后，最終確定魚鰾粉末中明顯存在的許多條或塊狀物及類球形物質分別為平滑肌纖維及蛋白質，這也是首次對動物此類特定組織的顯微特征進行研究，以期為以后相關顯微鑒別研究提供參考。此外還發現，只有直接刮取魚鰾表面粉末并不能太細，才能觀察到相對完整的平滑肌纖維及蛋白，若按照常規粉末顯微鑒別制片方法則難以發現，這可能是之前尚無相關報道的原因之一。目前，市場上魚鰾鑒別方法以性狀鑒別為主，但對性狀接近的偽品尚無有效的區分手段，而本實驗發現的顯微特征可快速有效地做到這一點，對市場監控具有積極意義。

文獻報道，魚鰾是一種高蛋白、低脂肪，含有豐富氨基酸的水產資源［5］，故本實驗測定了其中總氮含有量以此評價蛋白質含有量。結果，11 批魚鰾總氮含有量介于14.16%～18.45%之間，可見市售品蛋白質含有量差異不明顯，并且海魚、河魚中亦然，表明不同魚種魚鰾的營養價值比較接近，也印證了其補益作用。

氨基酸具有多方面機能調節作用，如甘氨酸能維持中樞神經，提高免疫力，降低高膽固醇和高血脂；谷氨酸能解除氨對大腦的毒性，并促進消化道黏膜黏蛋白生成；精氨酸能促進生育及生長發育，促進創傷愈合及免疫調節能力［18］，故本實驗采用氨基酸分析儀法分析了11 批魚鰾中17 種氨基酸含有量，并在方法學考察時發現陰性無干擾，雜質及其他成分對含有量測定無影響，專屬性良好。

另外，為了保證收集到的魚鰾具有廣泛的市場代表性，本實驗購買的11 批樣品分別來自國內三大藥材市場，分別為河北安國藥材市場4 批、四川荷花池藥材市場4 批、安徽亳州藥材市場3 批，能比較客觀地反映該藥材國內發展現狀，以期為相關質量標準的修訂提供依據。