芩百清肺濃縮丸對肺炎支原體感染的影響

楊志敏，蒙艷麗，王慧慧，王曉溪，王偉明

（黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱150036）

肺炎支原體 （Mycoplasma pneumoniae，MP）是一種原核微生物，其細胞體積介于細菌與病毒之間，侵入機體后可粘附在宿主細胞表面，破壞細胞膜，引起肺泡損傷，從而損害肺功能。肺炎支原體肺炎 （Mycoplasma pneumoniaepneumonia，MPP）是由肺炎支原體引起的急性呼吸道感染性疾病，近年來難治性肺炎支原體肺炎病例數量明顯呈現上升趨勢［1-2］。

目前臨床治療肺炎支原體感染以大環內酯類抗生素為主，但大環內酯類藥物常引起較重的胃腸道反應，其耐藥菌株近年來也有上升趨勢［3-4］。中藥治療支原體肺炎具有獨特的優勢，由于其作用靶點眾多，表現出既能抑制肺炎支原體又可以保護肺上皮細胞，從而促進肺部損傷的修復，在臨床上取得了良好的治療效果。

芩百清肺濃縮丸（芩百） 是用于臨床治療小兒支原體肺炎的中藥制劑，由黃芩、百部、地龍等6 味中藥組成，具有清熱解毒、潤肺止咳的功效。前期實驗［5-6］表明其對肺炎支原體、肺炎雙球菌等具有良好的抑制作用，能促進氣道組織修復和提高免疫功能。

RAS／RAF／MEK／ERK 信號級聯通路又稱ERK通路，是將細胞表面受體信息傳遞到細胞內的主要信號轉導途徑之一，其中MEK 是級聯通路特異性決定因子的中心信號蛋白［7-9］。ERK 通路通過激酶級聯反應后，磷酸化激活的ERK1／2 由胞質轉位到核內，進而介導c-jun 等的轉錄活化，參與細胞增殖與分化、細胞骨架的構建等多種生物學反應［10］。

本研究利用支原體感染A549 細胞和BALB／c小鼠探究給藥前后對細胞增殖與凋亡的影響，以及對小鼠各組實驗樣本MEK、c-jun 表達的影響，初步探討芩百清肺濃縮丸促進肺上皮細胞增殖而產生修復作用的機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 芩百清肺濃縮丸，棕色薄膜包衣濃縮水丸，由黑龍江省中醫藥科學院制劑室生產，符合2015 年版《中國藥典》 丸劑下的各項規定；阿奇霉素分散片（批號274150404） 購自石藥集團歐意藥業有限公司。PPLO （批號7110677）購自美 國 BD 公 司；RPMI-1640 （貨 號SH30809.01）、胎牛血清（貨號SH30070.03） 購自美國Hyclone 公司；RNA 提取試劑盒 （貨號DP419） 購自中國天根生化科技（北京） 有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒（貨號G004-1） 購自南京建成生物工程研究所；Real-Time PCR 試劑盒（貨號A6020） 購自美國Promega 公司；Mouse anti-MEK antibody （貨號ab131517）、Mouse anti-c-jun antibody （貨號ab32137） 均購自美國Abcam 公司；Goat anti-mouse antibody （貨號ZB-2305） 購自北京中杉金橋生物技術有限公司；MTT （貨號M2128）、DMSO （貨號D2650） 購自美國Sigma 公司；引物均合成自上海生物工程技術有限公司。

1.2 儀器 M200 多功能酶標儀（奧地利Tecan 公司）；FACSCalibur 流式細胞儀（美國BD 公司）；Line Gene 9600 Real-Time PCR 儀（杭州博日科技有限公司）；熒光顯微鏡DP72 （日本Olympus公司）。

1.3 肺炎支原體 肺炎支原體 （批號ATCC15531） 購自美國Type Culture Collection 公司，培養于含20% 胎牛血清，10% 酵母的2.1%PPLO 培養基中，每隔7 d 傳代1 次。

1.4 細胞株 A549 細胞購自上海中科院細胞中心，細胞培養于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI 1640 完全培養基中，置于含5%CO2、37 ℃的恒溫培養箱，隔天換液。

1.5 動物 SPF 級6 周齡BALB／c 小鼠共60 只，體質量20～22 g，雌雄各半，購于遼寧長生生物技術股份 有限公 司，動物合 格證號211002300025153。小鼠飼養于室溫25 ℃和濕度60% GLP 實驗室。

2 方法

2.1 芩百清肺濃縮丸對A549 細胞的影響

2.1.1 含藥血清制備 18 只大鼠隨機分為空白組、模型組、芩百清肺濃縮丸組，每組6 只，用藥劑量按成人臨床劑量18 g／d 換算為大鼠等劑量后的5 倍灌胃給藥，即8.1 g／kg。空白組、模型組大鼠灌胃給予等量蒸餾水，1 次／d，連續7 d。最后1次給藥3 h 后，大鼠腹主動脈穿刺取血，離心，取上清，除菌，滅活，-20 ℃下保存備用。

2.1.2 MTT 法檢測細胞活性 取對數生長期的A549 細胞，以細胞濃度1×104／mL （每孔100 μL）接種于96 孔板中，分為空白組、模型組、10%芩百含藥血清組、20%芩百含藥血清組。除空白組外，其余組使用1×105CCU 肺炎支原體感染A549 細胞4 h，使用培養液洗去不黏附的肺炎支原體。芩百含藥血清組給予相應的含藥血清培養基200 μL，空白組與模型組給予等量空白組血清培養基，每組設3個復 孔。3 d 后，每孔加 入50 μL MTT 溶 液（5 mg／mL），培養4 h 后吸去孔內培養液，每孔再加入200 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，酶標儀測量490 nm 處各孔的吸光值（OD）。增殖率＝［（OD實驗組-OD模型組） ／OD模型組］ ×100%。

2.1.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 使用Annexin V／PI 雙染檢測細胞凋亡，收集生長狀態良好的A549 細胞，接種于6 孔板，每孔接種1.0×106個，置于5% CO2、37 ℃的恒溫箱中孵育24 h。按照“2.1.2” 項下進行分組、感染，給藥48 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化收集細胞，用PBS 洗滌細胞2 次，2 000 r／min 常溫下離心5 min，棄上清，加入500 μL 結合液懸浮細胞，加入5 μL Annexin V 混勻后，再加入5 μL PI 混勻，室溫避光孵育15 min，上機檢測。

2.2 芩百清肺濃縮丸對MP 感染小鼠的影響

2.2.1 分組、造模及給藥 小鼠隨機分為空白組、模型組、芩百清肺濃縮丸（低、中、高劑量） 組、阿奇霉素組，每組10 只。模型組和各給藥組小鼠滴鼻法感染20 μL 1×106CCU 肺炎支原體3 d，給藥組分別灌胃予藥芩百濃縮丸低劑量1.15 g／kg、中劑量2.3 g／kg、高劑量4.6 g／kg 及阿奇霉素32 mg／kg，1 次／d，給藥6 d。空白組和模型組給生理鹽水，給藥結束后處死小鼠取出肺組織，部分HE 染色和免疫組化，部分提取RNA。

2.2.2 HE 染色肺組織形態學觀察 小鼠肺組織取出后放在10%福爾馬林24 h，石蠟包埋，切片在二甲苯和不同濃度酒精中浸泡，蘇木素和伊紅染色，顯微鏡拍照觀察病變區及附近肺組織肺充血及肺出血、肺泡內滲出、肺泡及血管壁的中性粒細胞浸潤、肺泡壁增厚程度、肺透明膜的形成等病理變化。

2.2.3 免疫組織化學法觀察MEK、c-jun 蛋白表達 肺組織石蠟切片65 ℃恒溫箱烘1 h，過二甲苯脫蠟、脫苯，PBS 洗滌3 次，3% H2O2去離子水孵育2 min。枸櫞酸緩沖液中煮沸進行抗原修復，滴加一抗（MEK 1 ∶100，c-jun 1 ∶250），4 ℃過夜，PBS 洗 滌3 次。滴加反 應增強 液，室溫孵 育20 min，PBS 洗滌3 次。滴加增強酶標山羊抗兔IgG 聚合物，室溫孵育30 min，PBS 洗滌3 次。滴加DAB 溶液顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，分化、沖洗反藍，脫水、透明、封片、閱片。

2.2.4 RT-PCR 實驗檢 測MEK、c-junmRNA 表達 各組小鼠肺組織收集后加入TRIzol 試劑提取RNA，經酶標儀檢測濃度后，RNA 稀釋至100 ng／μL。實驗反應體系為1 μL 組織RNA，上下游引物各1 μL，17 μL 反應液（反應液根據PCR 試劑盒說明書配制）。擴增條件為95 ℃、10 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40 個循環；溶解曲線分析95 ℃、10 s，臺階采樣，臺階溫度0.5 ℃。引物序列為MEK正向5'-CCTGCAACTGGAAGA AGGAA-3'，反向5'-AGACAGGAGGGTTGTGGATG-3'。c-jun正向5'-TCCACGGAGAAGAAGCTCAC-3'，反 向 5'-CCTCTGGGTCAGGAAAGTTG-3'。β-actin正 向5'-GACGGCCAGGTCATCACTATTG-3'，反向5'-AGGAAGGCTGGAAAA GAGCC-3'。

2.3 統計學分析 采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析，數據以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 芩百清肺濃縮丸對A549 細胞增殖的影響 如圖1、表1 所示，隨著芩百含藥血清藥物濃度的升高，A549 細胞OD增大（P＜0.05），給藥組細胞增殖率分別為36.23%、58.37%。

圖1 各組OD （n＝3）Fig.1 OD in each group （n＝3）

表1 芩百清肺濃縮丸對A549 細胞增殖率的影響（n＝3）Tab.1 Effects of QQPs on the proliferation rate of A549 cells （n＝3）

3.2 芩百清肺濃縮丸對A549 細胞凋亡的影響如圖2～3 所示，與空白組相比，模型組細胞凋亡率升高（P＜0.05），芩百含藥血清組細胞凋亡率減少（P＜0.05）。

3.3 肺組織的病理改變 如圖4 所示，模型組出現肺泡塌陷，肺泡壁充血，支氣管上皮脫落，大量炎性細胞浸潤；芩百組癥狀均有所改善，其中高、中劑量組與空白組的肺組織相似，低劑量組與阿奇霉素組相似，高劑量組僅有少量充血和炎性細胞浸潤。

3.4 免疫組織化學法觀察MEK、c-jun 蛋白表達 模型組細胞顏色著色淺且面積較小，蛋白表達較低，IHC＜3 為陰性。空白組與芩百高、中、低劑量組均著色深，阿奇霉素組著色淺。與模型組比較，芩百高、中劑量 組 MEK 蛋白表 達升高（P＜0.05），高劑量 組表達 高于低 劑量組（P＜0.05）；芩百高、中、低劑量組c-jun 蛋白表達升高（P＜0.05），高劑量組表達高于低劑量組（P＜0.05）。見圖5～8。

圖2 流式細胞術檢測A549 細胞凋亡Fig.2 Resultant apoptosis rate of A549 cells by flow cytometry

圖3 芩百清肺濃縮丸對A549 細胞凋亡的影響（n＝3）Fig.3 Effects of QQPs on apoptosis of A549 cells （n＝3）

圖4 肺組織病理檢測（HE，×20）Fig.4 Pathological examination of lung tissue （HE×20）

圖5 芩百對肺組織MEK 蛋白表達影響（×200）Fig.5 Effects of QQPs on expression of MEK protein in lung tissue （×200）

3.5 芩百清肺濃縮丸對小鼠MEK、c-junmRNA 表達影響 與模型組比較，芩百高、中、低劑量組及阿奇霉組MEKmRNA 表達升高（P＜0.05），其中芩百高劑量組較中、低劑量組表達升高（P＜0.05）；芩百高、低劑量 組c-junmRNA 表達升 高（P＜0.05）；芩百高劑量組與低劑量組c-jun表達較中劑量組升高（P＜0.05）。見圖9～10。

圖6 MEK 免疫組化評分（n＝10）Fig.6 Immunohistochemical scores of MEK （n＝10）

圖7 芩百對肺組織c-jun 蛋白表達影響（×200）Fig.7 Effects of QQPs on expression of c-jun protein in lung tissue （×200）

圖8 c-jun 免疫組化評分（n＝10）Fig.8 Immunohistochemical scores of c-jun （n＝10）

4 討論

圖9 芩百對肺組織MEK mRNA 表達影響（n＝10）Fig.9 Effects of QQPs on expression of MEK mRNA in lung tissue （n＝10）

圖10 芩百對肺組織c-jun mRNA 表達影響（n＝10）Fig.10 Effect of QQPs on expression of c-jun mRNA in lung tissue （n＝10）

肺炎支原體所引起的肺炎支原體肺炎占社區獲得性肺炎的40%，容易在兒童中引起暴發流行，給患者肺部造成嚴重損傷，可累及多個系統病變，甚至直接威脅患者的生命健康［11-13］。芩百清肺濃縮丸是治療支原體肺炎的優勢中藥制劑，具有多年臨床研究基礎，然而在確切療效基礎上，其作用機制尚不明確。課題組前期實驗研究［6］提示，芩百清肺濃縮丸給藥組能明顯改善肺炎支原體對大鼠肺組織結構造成的異常損害，促進上皮修復和纖毛再生。本研究揭示芩百清肺濃縮丸通過提高MEK 與c-jun 的表達，進而促進肺上皮細胞增殖而起到修復作用。

本實驗首先通過MTT 法對體外培養的A549 細胞增殖進行測定，顯示芩百清肺濃縮丸可在體外促進肺炎支原體感染A549 細胞的增殖。進一步通過流式細胞術檢測了芩百清肺濃縮丸對A549 細胞凋亡的影響，也表明芩百能夠有效降低肺炎支原體感染A549 細胞的凋亡。體外實驗揭示了芩百可能存在的促增殖效果，進一步的動物實驗更好的說明芩百在治療肺炎支原體肺炎，修復肺損傷方面的作用。本研究目的是探討芩百對MEK 與c-jun 表達影響中潛在的促增殖修復機制，有研究顯示，通過激活Ras-Raf-MEK-ERK 信號通路，能夠使全腦I／R后小鼠的認知功能障礙得到改善［14］；通過激活該通路，能夠誘導大鼠血管再生、加速創傷的愈合［15］。RAS／RAF／MEK／ERK 信號通路可以將細胞外信號，如生長因子等傳遞入細胞核內而磷酸化核內轉錄因子c-jun，從而促進細胞周期G1到S 期的進展［16］。本研究運用RT-PCR 和免疫組織化學法，闡明芩百清肺濃縮丸對MEK、c-junmRNA 與蛋白表達的影響，結果顯示芩百清肺濃縮丸高中低劑量組均能上調MEK 與c-jun 表達。

綜合所述，芩百清肺濃縮丸可能通過激活RAS／RAF／MEK／ERK 信號通路，促進小鼠受損肺上皮細胞的增殖與修復，從而改善肺炎支原體感染后的肺部損傷，發揮治療肺炎支原體肺炎的作用。