不同種植模式的霍山石斛對小鼠急性肝損傷的保護作用

李志強周紅秋歐陽 臻戴 軍 魏 淵韓邦興?

（1.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江212013； 2.安徽省中藥資源保護與持續利用工程實驗室，安徽 六安237012； 3.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安237012）

霍山石斛Dendrobium huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng 為蘭科石斛屬多年生草本植物，在我國有著悠久的藥用歷史。霍山石斛性微寒，味甘、淡，在《本草綱目拾遺》 中有“清胃除虛熱，生津已勞損” 的記載［1］。現代藥理研究［2-4］發現霍山石斛具有保肝、抗氧化、抗衰老、調節免疫、抗腫瘤和抗白內障等功效。因其廣泛的藥理活性，霍山石斛享有“中華仙草之最” 的美譽［5］。

野生霍山石斛多與苔蘚等附生在一起，生長在半陰性、濕潤的峭壁和石縫間，依靠須根從空氣中吸收水分，濕度對其光合作用影響較大，強光不利于其生長［6］。霍山石斛分布區域窄、自然繁殖率低，對生長環境要求十分苛刻，加之人們過度采挖，野生霍山石斛資源瀕臨滅絕［7］。霍山石斛種子在自然環境下萌發率極低，而組織培養快速繁殖技術可以通過類原球莖等途徑獲取成活率高的霍山石斛種苗［8］。霍山石斛種苗的培育模式主要為仿野生種植、林下石子種植以及設施種植模式。仿野生種植模式完全模擬野生霍山石斛的生長環境，選取具有適宜溫濕度及光照等條件的山崖，將種苗栽植于山崖石縫中使其自然生長。林下石子種植模式則選擇山坡中通風較好、疏密適中的闊葉林、針葉林或針闊混交林，根據山體地形整理成梯田形狀，采用石子和苔蘚等作為基質［9］。設施種植是在大棚中控制溫度濕度、通風和光照，以松樹皮等作為基質進行種植［10］。霍山石斛的仿野生和林下石子種植都采用了生態種植模式，即通過模擬野生霍山石斛的自然生長環境，以期霍山石斛品質和療效接近或達到野生霍山石斛水平。生態種植注重生態系統的整體性，提高栽培藥材質量，促進中藥資源的可持續發展［11］。不同種植模式的藥材所受光照、溫度等環境條件不同，影響了次生代謝產物的積累量，導致其臨床療效產生差異［12］。隨著霍山石斛市場需求量的增加，人們對霍山石斛品質的要求不斷提高，而不同模式種植的霍山石斛是否存在藥效差異，何種種植模式下的霍山石斛具有最佳藥效以及產生差異的相關物質基礎，目前尚未見報道，生態種植模式的霍山石斛藥效是否優于設施種植仍待驗證。課題組前期研究［13］發現，霍山石斛對四氯化碳致小鼠急性肝損傷具有顯著的保護作用。本研究使用小鼠不同急性肝損傷模型評價生態種植模式的仿野生種植、林下石子種植和設施種植模式的霍山石斛對肝損傷的保護作用，為優質霍山石斛生態種植模式規范化及其推廣提供理論依據，以期為霍山石斛臨床應用及資源可持續發展奠定基礎。

1 材料

1.1 動物 SPF 級C57BL／6 小鼠，雄性，8 周齡，體質量（20±2） g，購自江蘇大學實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK （蘇） 2018-0053，實驗室適應性飼養1 周后用于正式實驗，維持12 h 明暗交替照明，自由飲水、進食。

1.2 藥物 仿野生種植、林下石子種植和設施種植霍山石斛Dendrobium huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng 鮮品均由皖西學院韓邦興教授提供和鑒定。石斛榨汁液的制備參考課題組前期文獻［12］，將新鮮的石斛去根洗凈，剪段，稱取10 g，置于榨汁機中，加入100 mL 蒸餾水榨汁，用200 目濾布過濾，于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3 試劑 對乙酰 氨基酚 （APAP，批 號FD170246）、環磷酰胺（CTX，批號DA110067） 購自薩恩化學技術 （上海） 有限公司；四氯化碳（CCl4，批號20170803） 購自國藥集團化學試劑有限公司；谷丙轉氨酶（ALT，批號20180610）、谷草轉氨酶 （AST，批 號 20180607）、丙二醛（MDA，批號20180608）、超氧化物歧化酶（SOD，批號20180607） 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器 Spectra Max 190 型酶標儀（美國MD公司）；SK-Ⅰ快速混勻器 （江蘇中大儀器廠）；IKA T10 basic-S25 組織勻漿器（德國IKA 公司）；Pic017 臺式離心機 （美國Thermo Fisher 公司）；Model 754 型紫外分光光度計（上海現科儀器有限公司）；TE601-L 電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

2.1.1 CCl4肝損傷模型 將C57BL／6 小鼠隨機分為8 組，每組10 只，分別為空白對照組、模型組、霍山石斛仿野生種植低劑量組［生藥1.25 g／kg，參照《中國藥典》 石斛用量］、霍山石斛仿野生種植高劑量組（生藥7.5 g／kg）、霍山石斛林下石子種植低劑量組（生藥1.25 g／kg）、霍山石斛林下石子種植高劑量組（生藥7.5 g／kg）、霍山石斛設施種植低劑量組（生藥1.25 g／kg） 和霍山石斛設施種植高劑量組（生藥7.5 g／kg）。各給藥組連續灌胃給藥14 d，1 次／d，正常組和模型組同時給予等量的生理鹽水，末次給藥2 h 后，模型組和霍山石斛給藥組腹腔注射0.5% CCl4橄欖油溶液（10 mL／kg） 進行肝損傷造模［13］，空白對照組注射等量的橄欖油，禁食不禁水，12 h 后眼底靜脈竇采血，并取出肝臟。

2.1.2 APAP 肝損傷模型 分組同“2.1.1” 項下分組，各給藥組連續灌胃給藥14 d，1 次／d，末次給藥2 h 后，模型組和各給藥組腹腔注射APAP（500 mg／kg） 進行肝損傷造模［14］，空白對照組注射等量生理鹽水，禁食不禁水，12 h 后眼底靜脈竇采血，并取出肝臟。

2.1.3 CTX 肝損傷模型 分組同“2.1.1” 項下分組，各給藥組連續灌胃給藥14 d，1 次／d，空白對照組注射等量生理鹽水，第6 天開始，模型組和各給藥組每天腹腔注射CTX （80 mg／kg） 進行肝損傷造模［15］。末次給藥后，禁食不禁水，12 h 后眼底靜脈竇采血，并取出肝臟。

2.2 血清指標及肝組織中相關酶的測定 小鼠血樣于37 ℃靜置30 min，3 800 r／min 離心10 min，取血清，按照試劑盒的說明分別測定小鼠血清中ALT 和AST 水平。稱取肝臟相同部位的肝組織制成10%肝勻漿，3 800 r／min 離心10 min，取上清，按試劑盒說明檢測SOD 及MDA 水平。

2.3 肝臟病理組織切片觀察 取小鼠肝臟相同部位組織，置于10% 甲醛中浸泡固定，常規石蠟包埋，切片，HE 染色，光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理學變化。

2.4 統計學分析 采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統計分析，數據以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 CCl4肝損傷模型

3.1.1 不同種植模式霍山石斛對CCl4肝損傷小鼠血清中ALT、AST 水平和肝組織勻漿中SOD、MDA水平的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST 水平升高（P＜0.01）；肝組織中SOD 水平降低，MDA 水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，仿野生種植高劑量組和林下石子種植高劑量組ALT、AST 水平降低（P＜0.05），其中ALT 分別降低了46.10%、53.59%，AST 分別降低了24.90%、29.47%；而設施種植高劑量組ALT 和AST 分別降低了 12.30%、11.85%，差異無 統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，各給藥組均能提高SOD 水平（P＜0.01），抑制MDA 水平（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

3.1.2 不同種植模式霍山石斛對CCl4肝損傷小鼠肝臟病理變化的影響 空白對照組小鼠肝細胞排列正常呈條索狀，以小葉中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，無炎細胞浸潤；模型組小鼠肝小葉結構紊亂，肝細胞核固縮濃染，肝細胞炎癥浸潤；各種植模式霍山石斛給藥組肝組織與模型組相比病理變化減輕，肝小葉內肝板排列較整齊，見圖2。

3.2 APAP 肝損傷模型

圖1 不同種植模式霍山石斛對CCl4 致肝損傷小鼠血清中ALT、AST 和肝組織勻漿中SOD、MDA 水平的影響（n＝10）Fig.1 Effects of differently cultivated DH on the serum ALT and AST levels，and hepatic SOD，MDA of mice with CCl4-induced liver injury （n＝10）

圖2 CCl4 致肝損傷小鼠肝臟病理學變化（×200）Fig.2 Hepatic pathological changes of mice with CCl4-induced liver injury （×200）

3.2.1 不同種植模式霍山石斛對APAP 肝損傷小鼠血清中ALT、AST 水平和肝組織勻漿中SOD、MDA 水平的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST 水平升高，肝組織中SOD 水平降低，MDA 水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，仿野生種植低高劑量組和林下石子種植低高劑量組ALT 分別降低了18.55%、37.00%、26.66%、29.54% （P＜0.05，P＜0.01），AST 分別降低了36.83%、43.82%、41.19%、32.61% （P＜0.01）；設施種植高劑量組AST 水平降低了33.63%（P＜0.01）。與模型組比較，林下石子種植低、高劑量組SOD 水平分別升高了21.23%、21.20%（P＜0.05），設施種植高劑量組SOD 水平升高了20.50% （P＜0.01）。與模型組比較，林下石子種植低高劑量組MDA 水平分別下降了62.22%、46.25% （P＜0.01），設施種植低高劑量組MDA 分別降低了1.51% （P＞0.05）、62.22% （P＜0.01）。見圖3。

圖3 不同種植模式霍山石斛對APAP 致肝損傷小鼠血清中ALT、AST 和肝組織勻漿中SOD、MDA 水平的影響（n＝10）Fig.3 Effects of differenly cultivated DH on serum ALT and AST levels and hepatic SOD，MDA in mice with APAP-induced liver injury （n＝10）

3.2.2 不同種植模式霍山石斛對APAP 肝損傷小鼠肝臟病理變化的影響 空白對照組小鼠肝小葉結構未發生病理改變，細胞核明顯，無炎細胞浸潤；模型組小鼠肝小葉有點狀壞死，肝細胞腫脹，炎性細胞浸潤；不同種植模式霍山石斛給藥組肝組織與模型組相比有改善，肝細胞腫脹，但肝細胞排列較正常，炎性細胞浸潤減少，見圖4。

3.3 CTX 肝損傷模型

3.3.1 不同種植模式霍山石斛對CTX 肝損傷小鼠血清中ALT、AST 水平和肝組織勻漿中SOD、MDA水平的影 與正常對照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST 水平升高（P＜0.01），肝組織中SOD 水平降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，仿野生種植高劑量組和林下石子種植高劑量組ALT 分別降低了23.79%、9.07%，AST 分別降低了34.43%、25.35%，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），設施種植高劑量組ALT 和AST 分別降低了7.44% （P＜0.05）、8.69%（P＞0.05）。與模型組比較，生態種植模式的仿野生低高劑量組和林下石子種植低、高劑量組SOD水平升高了18.33%、12.81%、13.04%、11.75%，差異具有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，仿野生種植高劑量組MDA 水平下降了38.61%（P＜0.01）。見圖5。

3.3.2 不同種植模式霍山石斛對CTX 肝損傷小鼠肝臟病理變化的影響 空白對照組小鼠肝組織結構正常，肝小葉清晰可辨，肝細胞排列整齊，細胞核體積較大位于細胞中央；模型組小鼠肝組織出現明顯的病理變化，肝細胞排列紊亂，炎性浸潤嚴重；與模型組比較，不同種植模式霍山石斛給藥組小鼠肝細胞腫脹和胞質疏松程度減輕，小葉結構較清晰，細胞排列較整齊，點狀壞死減少。見圖6。

圖4 APAP 致肝損傷小鼠肝臟病理學變化（×200）Fig.4 Hepatic pathological changes of mice with APAP-induced liver injury （×200）

圖5 不同種植模式霍山石斛對CTX 致肝損傷小鼠血清中ALT、AST 和肝組織勻漿中SOD、MDA 水平的影響（n＝10）Fig.5 Effects of differently cultivated DH on serum ALT and AST levels，and hepatic SOD，MDA in mice with CTX-induced liver injury （n＝10）

4 討論

圖6 CTX 致肝損傷小鼠肝臟病理學變化（×200）Fig.6 Hepatic pathological changes of mice with CTX-induced liver injury （×200）

隨著大健康產業的快速發展，霍山石斛因其廣泛的藥理活性，市場需求量劇增。目前霍山石斛存在著多種種植模式，不同種植模式對藥材品質的影響一直是醫藥科研工作者關注的重點。甘金佳等［16］研究了不同栽培方式金線蓮的品質，由于栽培基質的松密度透氣性和微生物含有量的不同，使得金線蓮根數和根長度差異較大，且林下栽培方式更有利于有效成分黃酮和多糖含有量的積累。周鵬等［17］研究了不同種植方式黃芪4 種黃酮類成分和總黃酮的含有量，發現野生品種黃芪中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷和總黃酮的含有量高于栽培品種。中藥生態種植根據藥用植物生理和生態特性，在遵循自然規律的基礎上優化種植環境，改善藥用植物的生理狀況，可使藥材品質和療效達到最佳［18］。霍山石斛的主要種植模式有采用生態種植的仿野生種植模式和林下石子種植模式，以及在大棚中種植的設施種植模式，關于這幾種種植模式的霍山石斛的藥效差異至今尚未有比較，本研究采用體內動物實驗的方法，首次比較了不同種植模式的霍山石斛對小鼠肝損傷保護的作用。

課題組前期研究發現對肝損傷的保護作用是霍山石斛多種藥理活性之一［13］，而肝損傷藥效研究具有較好的量化指標，如肝酶學的改變、物質合成及生物降解功能的變化等［19］。Hu 等［20］研究人參皂苷Rk1 對APAP 致小鼠肝損傷的保護作用，發現人參皂苷Rk1 給藥組ALT、AST、MDA 水平顯著降低，同時肝臟抗氧化劑SOD 和GSH 水平均升高，表明人參皂苷Rk1 對APAP 誘導的肝毒性具有保護作用。陳春等［21］研究酢漿草對CCl4致急性肝損傷大鼠的保護作用，通過檢測大鼠血清中ALT、AST、T-SOD、MDA 等發現酢漿草對CCl4致急性肝損傷大鼠具有保護作用。本實驗采用多種肝損傷模型小鼠進行了多種肝損傷量化指標的測定，結果均顯示生態種植的霍山石斛保肝藥效優于設施種植。

在不同種植模式霍山石斛對CCl4致肝損傷的保護作用研究中，模型組與空白對照組比較，ALT、AST 和MDA 水平顯著升高，SOD 水平顯著下降，并且肝細胞結構嚴重破壞，肝細胞壞死和變性，說明模型復制成功，各給藥組均能不同程度改善血清指標，同時減輕肝細胞變性和壞死程度，說明不同種植模式霍山石斛均對CCl4致肝損傷有一定保護作用。但是生態種植模式霍山石斛降低ALT和AST 水平的效果優于設施種植模式，綜合評價不同模式霍山石斛降低ALT、AST、MDA 水平，升高SOD 水平的效果，生態種植模式的霍山石斛對CCl4致肝損傷的保護作用最佳。本研究使用了藥物性肝損傷CTX 模型以進一步研究不同種植模式霍山石斛對肝損傷的保護作用。在此模型中，生態模式的仿野生和林下石子種植組SOD 升高，設施種植組升高SOD 無顯著性差異。綜合評價其他生化指標，生態模式種植的霍山石斛保肝效果最佳。在APAP 肝損傷模型中，仿野生種植和林下石子種植霍山石斛保肝效果顯著，設施種植霍山石斛效果也較好。綜合各組霍山石斛保肝效果，生態種植模式霍山石斛效果最佳。

生態種植與設施種植的霍山石斛對不同肝損傷小鼠的保護效果的差異，不僅與不同肝損傷機制有關，而且與不同環境下霍山石斛的次生代謝產物積累量有關。霍山石斛所含化學成分包括多糖、生物堿、黃酮、酚類、氨基酸和微量元素等［22］。其中，霍山石斛多糖能保護小鼠亞急性酒精性肝損傷，其保肝活性與清除自由基，抑制脂質過氧化，下調肝組織CYP2E1、TNF-α 和IL-1β 表達相關［23］。石斛類藥材所含生物堿主要為石斛堿，金釵石斛中的生物堿對CCl4所致急性肝損傷有顯著改善作用，與其抑制炎癥反應有關［24］。石斛酚在抗白內障、抑制醛糖還原酶，柚皮素在抗氧化、抗炎等方面具有活性［25-27］。盡管霍山石斛不同種植模式產生的藥效差異物質基礎尚不明確，本研究證實了生態種植霍山石斛保肝藥效的更優品質。

綜上所述，本實驗研究的生態種植模式與設施種植模式霍山石斛對小鼠肝損傷的保護作用存在差異，生態種植模式的霍山石斛保肝效果優于設施種植。造成藥效差異的原因可能與不同種植模式的栽培基質、環境等相關，從而引起霍山石斛的性狀、有效成分種類及含有量的差異，相關物質基礎及具體作用機制仍待進一步研究。