甘木通乙酸乙酯提取物對低糖缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

黃海潮，何 欣，周 捷?，聶 陽，趙 晉，徐單單

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州510520； 2.中山大學(xué)腫瘤防治中心，廣東 廣州510060； 3.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 東莞523808）

甘木通為毛茛科絲鐵線蓮Clematis filamentosaDunn.屬，其葉及根入藥，有活血通脈降壓、鎮(zhèn)靜安神之功效［1］。甘木通主要分布于嶺南地區(qū)，為華南珍稀藥材，臨床用于冠心病、心絞痛、心肌梗死等心血管疾病治療。目前對于甘木通的研究報道集中于其成分提取以及其治療心血管疾病作用及機制，對其在神經(jīng)退行性疾病中的作用鮮見報道。

缺血性腦卒中又稱為腦梗死，其患病率、死亡率、復(fù)發(fā)率、致殘率高［2］。中醫(yī)學(xué)關(guān)于腦梗死主要病位證素分析結(jié)合肝陽上亢證、風(fēng)火閉竅證、痰火閉竅證等病證分析［3］，而甘木通可用于肝經(jīng)有熱、肝陽上亢、脈絡(luò)瘀阻等相關(guān)疾病治療前期實驗研究［4］表明，甘木通能有效降低氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)損傷，提示其在神經(jīng)退行性疾病中的潛在治療作用，設(shè)想其對于腦中風(fēng)防治有一定的作用。

缺血性腦卒中發(fā)病機制為血管堵塞造成腦血流量減少，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，引起組織損傷。本研究通過模擬腦缺血病理生理發(fā)展過程，以PC12細(xì)胞建立體外缺血性中風(fēng)的細(xì)胞模型，研究甘木通乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract fromClematis filamentosaDunn.EAECFD） 對缺血性中風(fēng)的影響及作用機制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12細(xì)胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所）。

1.2 藥物與試劑 甘木通（批號120618，廣東康美藥業(yè)股份有限公司），經(jīng)廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院聶陽副主任藥師鑒定為正品；DMEM 培養(yǎng)基、馬血清（美國Gibco 公司）；胎牛血清（FBS，批號140313，杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶（批號2014B015，美國Amresco 公司）；CCK-8 試劑盒［批號GH802，東仁化學(xué)科技（上海） 有限公司］；Triton-X、二甲基亞砜（DMSO） （美國Sigma公司）；PBS （pH ＝7.2，杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA） 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；BCA 法蛋白定量試劑盒、AnnexinⅤ-FITC／PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1） （上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；B 淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X 蛋白（Bax）、β-actin、活化型半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3） （美國CST 公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器 311 型細(xì)胞培養(yǎng)箱、Sorvall ST 40 臺式離心機（美國Thermo 公司）；DMIL 熒光倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；Microplate Reader 酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek 公司）；BD FACS Verse 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）。

2 方法

2.1 甘木通乙酸乙酯提取物制備 取甘木通干燥粉碎，過30 目篩，參考文獻(xiàn)［5］ 進(jìn)行初提取，得初提液，蒸干；用乙酸乙酯再提取，大孔樹脂純化提取液，得洗脫液并干燥至恒定質(zhì)量，提取物得率為1.01%；所得提取物用DMEM 培養(yǎng)液超聲溶解，經(jīng)無菌濾膜過濾備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC12 細(xì)胞用含有10% FBS 和5%馬血清的DMEM 培養(yǎng)基（pH＝7.4） 培養(yǎng)，放置于培養(yǎng)條件為95%空氣、5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h 換液1 次，待細(xì)胞生長覆蓋約至80%，用胰酶消化傳代，培養(yǎng)于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁待用，于實驗前12 h 更換成無血清低糖DMEM 培養(yǎng)基。

2.3 缺氧細(xì)胞模型構(gòu)建 取實驗待用細(xì)胞，根據(jù)參考文獻(xiàn)［6］ 方法模擬腦中風(fēng)缺氧復(fù)氧模型。將細(xì)胞置于95% N2、5% CO2、37 ℃密閉容器中，培養(yǎng)0.5、1、2、4、8、12、24 h；再將細(xì)胞置于37 ℃、飽和濕度、95% 空氣、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h；然后加入10 μL CCK-8 檢測試劑，37 ℃溫育2 h，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照組，酶標(biāo)儀測定450 nm 處吸光度（OD）。細(xì)胞存活率＝ （OD實驗組／OD對照組） ×100%。根據(jù)試驗結(jié)果選擇合適的缺氧時間制作缺氧模型。

2.4 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞活性的影響 取實驗待用細(xì)胞，根據(jù)前期實驗結(jié)果［4］選擇提取物濃度，分為對照組，模型組（缺氧4 h），甘木通提取物高、中、低劑量組（100、50、25 μg／mL），陽性對照組（尼莫地平）。通過CCK-8檢測細(xì)胞存活率，酶標(biāo)儀測定450 nm 處吸光度（OD），計算細(xì)胞存活率。

2.5 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞LDH 漏出的影響 根據(jù)“2.4” 項下實驗分組處理細(xì)胞，根據(jù)LDH 試劑盒操作說明處理細(xì)胞，并測定各組細(xì) 胞吸光 度 （OD）。LDH 漏出率＝（OD實驗組／OD模型組） ×100%。

2.6 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞凋亡的影響 將PC12 細(xì)胞接種于6 孔板中，按“2.4” 項下分組處理細(xì)胞，小心吸去原培養(yǎng)液，用PBS 輕輕沖洗，胰酶消化，收集細(xì)胞懸液，以1 000 r／min離心10 min，棄去上清，根據(jù)試劑盒提供的步驟進(jìn)行Annexin V-FITC／PI 染色，流式細(xì)胞儀檢測不同分組PC12 細(xì)胞的凋亡率。將PC12 細(xì)胞接種于6 孔板中，小心吸去原培養(yǎng)液后，用PBS洗滌后，加入4%多聚甲醛固定15 min 后，PBS 沖洗，Hoechst 33258 染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。

2.7 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞線粒體膜電位的影響 按“2.4” 項下分組處理后，收集細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至2×105個，根據(jù)試劑盒說明操作，染色，采用流式細(xì)胞儀檢測。

2.8 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 將PC12 細(xì)胞接種于6 孔板中，按“2.4” 項下分組處理后，用冰冷的PBS 沖洗2 次，收集細(xì)胞并冰凍裂解，12 000 r／min 離心15 min 去除雜質(zhì)，吸取上清液，BCA 法測定蛋白量。用含12% SDS-PAGE 膠分離總蛋白，然后轉(zhuǎn)移PVDF 膜 上，5% BSA 封 閉90 min，加入一 抗（Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3），冰凍孵育過夜。洗膜后，加入二抗，37 ℃孵育1 h，再洗1 遍，觀察各蛋白表達(dá)量并與內(nèi)參（β-actin） 作比較。

2.9 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞SOD、MDA 水平的影響 將PC12 細(xì)胞接種于24孔板中，按“2.4” 項下分組處理后，去除原培養(yǎng)液，根據(jù)參考文獻(xiàn)［7］方法處理后，按說明書測定細(xì)胞中SOD 和MDA 水平。

2.10 統(tǒng)計學(xué)分析 利用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同缺氧時間對PC12 細(xì)胞存活率的影響 隨著缺氧時間的增加，PC12 細(xì)胞存活率逐漸下降。與對照組（缺氧0 h） 比較，PC12 細(xì)胞缺氧2～24 h 細(xì)胞存活率降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖1。本實驗缺氧造模時間設(shè)為4 h。見圖1。

3.2 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞存活率的影響 與模型組比較，甘木通乙酸乙酯提取物提高細(xì)胞存活率（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。

3.3 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞LDH 漏出的影響 在缺氧條件下，細(xì)胞中LDH 漏出率增加（P＜0.01）。與模型組比較，甘木通乙酸乙酯提取物能降低 LDH 漏出率 （P＜0.05，P＜0.01），表明甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。見圖3。

圖1 不同缺氧時間對PC12 細(xì)胞存活率的影響（n＝6）Fig.1 Effects of different hypoxic time on PC12 cell survival rate （n＝6）

圖2 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞存活的影響（n＝6）Fig.2 Effects of EAECFD on the survival of hypoxic PC12 Cells （n＝6）

3.4 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡很少，凋亡率為6.8%；模型組細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，凋亡率為46.3%，并且有部分細(xì)胞壞死；陽性對照組細(xì)胞凋亡率為11.3%；不同質(zhì)量濃度甘木通乙酸乙酯提取物作用，凋亡細(xì)胞比例逐漸減少，細(xì)胞凋亡率分別為39.6%、27.8%、15.5%，見圖4。Hoechst 33258 染色結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞核形態(tài)完整，基本沒有凋亡細(xì)胞少；模型組出現(xiàn)多處亮色熒光，表明細(xì)胞凋亡形態(tài)明顯；陽性對照組細(xì)胞基本趨于正常；甘木通乙酸乙酯提取物組正常細(xì)胞增多，見圖5。

圖5 Hoechst 33258 染色觀察各組細(xì)胞凋亡細(xì)胞形態(tài)（×400）Fig.5 Apoptotic cell morphology by Hoechst 33258 staining （×400）

3.5 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞線粒體膜電位的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞的線粒體膜電位下降（P＜0.01）；與模型組比較，甘木通乙酸乙酯提取物中、高劑量組及陽性對照組線粒體膜電位升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖6。

3.6 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)影響線粒體膜的通透性，從而啟動線粒體凋亡信號通路［8］。cleaved caspase-3 是caspase-3 的活化形式，其決定細(xì)胞凋亡程度［9］。與對照組比較，模型組Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，Bax／Bcl-2 比例及Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，甘木通乙酸乙酯提取物組（中、高劑量） Bcl-2 蛋白表達(dá)增加，Bax／Bcl-2 比例及Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），見表1、圖7。

圖6 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞線粒體膜電位的影響（n＝3）Fig.6 Effects of EAECFD on mitochondrial membrane potential in hypoxic PC12 cells （n＝3）

表1 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響（%，， n＝3）Tab.1 Effects of EAECFD on the expression of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in hypoxic PC12 cells （%，， n＝3）

表1 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響（%，， n＝3）Tab.1 Effects of EAECFD on the expression of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in hypoxic PC12 cells （%，， n＝3）

注：與對照組相比，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖7 Western blot 檢測凋亡蛋白表達(dá)Fig.7 Apoptosis-related proteins expression by Western blot

3.7 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞SOD、MDA 水平的影響 與對照組比較，模型組SOD 水平降低，MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，甘木通乙酸乙酯提取物組SOD 水平升高，MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖8。

4 討論

圖8 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細(xì)胞SOD、MDA 水平的影響（n＝6）Fig.8 Effects of EAECFD on SOD，MDA levels of hypoxic PC12 cells （n＝6）

近年來研究［10］表明，腦中風(fēng)的病理生理機制為各種因素引起的神經(jīng)元的凋亡以及壞死，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)不可逆的損傷，從而使中風(fēng)加深加重。本實驗根據(jù)缺血性中風(fēng)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的缺氧／復(fù)氧的病理機制，建立缺血性中風(fēng)的細(xì)胞模型。該模型更能真實的模擬缺血缺氧的病理生理特征，減少實驗的影響因素［6］。

流式細(xì)胞儀檢查細(xì)胞凋亡，對PC12 細(xì)胞凋亡進(jìn)行分析。在甘木通乙酸乙酯提取物的作用下，細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，表明甘木通乙酸乙酯提取物可以有效抑制缺氧引起的細(xì)胞凋亡。并且Hoechst 33258 染色結(jié)果進(jìn)一步證明甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧細(xì)胞的保護(hù)作用。

JC-1 在細(xì)胞中以單體和聚合體形式存在，在正常細(xì)胞，由于線粒體的極性，JC-1 被攝入進(jìn)入線粒體形成多聚體，發(fā)出紅色熒光；而在凋亡的細(xì)胞中，細(xì)胞線粒體極性下降，JC-1 從線粒體釋放至胞質(zhì)，以單體形式存在，呈綠色熒光；通過不同熒光比值，檢測線粒體的相對膜電位。本實驗中，模型組中的線粒體膜電位明顯下降，而甘木通乙酸乙酯提取物可以明顯提高線粒體膜電位 （P＜0.05），提示甘木通乙酸乙酯提取物的保護(hù)作用可能與影響線粒體膜電位相關(guān)。

研究顯示Bcl-2 和caspase 蛋白家族均參與了腦缺血線粒體凋亡途徑［11］。2 種蛋白直接參與釋放細(xì)胞色素C （CytC） 的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的調(diào)節(jié)。Bcl-2 蛋白家族分為促凋亡蛋白（Bax、Bad等） 和抑制凋亡蛋白（Bcl-2），2 種功能相反的蛋白主要通過影響線粒體的膜電位以及CytC 水平影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程，2 者表達(dá)高低直接反映細(xì)胞凋亡情況［12］。caspase 蛋白家族在腦缺血活化明顯［13］。細(xì)胞中Bcl-2 低表達(dá)，可引起線粒體相關(guān)的細(xì)胞核固縮和DNA 裂解以及Cyt C 從線粒體釋放，導(dǎo)致活化型caspase-3 （cleaved caspase-3） 出現(xiàn)，表明細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)。蛋白印跡結(jié)果顯示，模型組Bax、cleaved caspase-3 表達(dá)增加，Bcl-2 表達(dá)明顯減少，說明細(xì)胞凋亡損傷明顯；甘木通乙酸乙酯提取物作用 后，Bcl-2 表達(dá)增 加，Bax、cleaved caspase-3 表達(dá)逐漸減少，說明甘木通乙酸乙酯提取物可以抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且其作用可能與線粒體凋亡途徑相關(guān)。

細(xì)胞凋亡開始時，細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽水平下降以及活性氧（ROS） 的升高，可引起煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的還原態(tài)NADH 和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸水平下降，并引起胞內(nèi)O2-聚集，影響線粒體膜電位，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［14］。MDA 是O2-引起的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其可以反映O2-對細(xì)胞的損失；而SOD 可有效清除細(xì)胞內(nèi)O2-，保護(hù)細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示甘木通乙酸乙酯提取物可有效降低缺氧誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞MDA 水平，提高SOD 水平，表明甘木通乙酸乙酯提取物能有效減少PC12 細(xì)胞氧化損傷，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

綜上所述，甘木通乙酸乙酯提取物具有神經(jīng)保護(hù)作用并且其作用方式可能是通過提高細(xì)胞內(nèi)SOD 水平，減少氧自由基對細(xì)胞的損害，影響線粒體凋亡途徑，從而抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞。研究表明，甘木通主要藥效成分為多種黃酮苷［15］，其神經(jīng)保護(hù)作用可能與甘木通提取物中的黃酮苷密切相關(guān)，本課題進(jìn)一步的研究將基于此，尋找突破口，全面深入探討甘木通對缺血性中風(fēng)的作用以及作用機制研究。