丹參注射劑體內外對糖尿病狀態(tài)下腎小管AT1 表達的影響

邵福平阮 旭李夢穎張孟孟楊 曄 尹登科

（1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥230012； 2.安徽省中醫(yī)藥科學院藥物制劑研究所，安徽 合肥230012； 3.中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥230012）

糖尿病腎病是導致終末期腎病的主要原因，在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中，近端小管發(fā)揮了重要作用［1］。近端小管驅動的炎性反應，不僅會誘導腎小管間質纖維化和腎小管萎縮，還可能引發(fā)腎小球硬化［2］。腎內腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的激活與糖尿病腎病密切相關［3］，腎小管血管緊張素Ⅱ受體1 （AT1） 途徑的激活會導致促炎介質的產(chǎn)生，細胞內外所形成的活性氧會進一步誘導腎損傷［4］。血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI） 和血管緊張素Ⅱ受體Ⅰ阻斷劑（ARB） 可減輕糖尿病腎病［5-6］。但是這些藥物療效仍然有限，無法阻止糖尿病腎病繼續(xù)發(fā)展為終末期器官衰竭［7］。臨床上已有報道采用丹參注射液聯(lián)合替米沙坦治療糖尿病腎病，結果表明丹參注射液和替米沙坦對糖尿病腎病患者具有良好的協(xié)同作用［8］。本課題組前期已經(jīng)證明丹參注射液可以改善腎小管的結構和功能［9］，但是對糖尿病腎小管的RAS 是否有影響尚不清楚。因此，本課題考察了丹參注射液對高糖誘導的NRK-52E 細胞以及糖尿病大鼠腎小管AT1 表達的影響。

1 材料

1.1 細胞株 NRK-52E 細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢）。

1.2 動物 SPF 級SD 大鼠購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心［動物生產(chǎn)許可證號SCXK （皖） 2017-001］，體質量100～140 g，雄性，所有動物均在25 ℃下飼養(yǎng)。大鼠可以自由獲得標準的嚙齒動物飲食和飲用水。所有動物實驗均按照安徽中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會指南進行。

1.3 藥物與試劑 丹參注射液（中國杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號1705083，生藥質量濃度1.5 g／mL）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma 公司，批號LS0130）；AT1 抗體（美國Abbkine 公司，批號ATQJN2001）；BCA 蛋白質檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號P0012S）；RIPA 裂解液（北京索萊寶科技有限公司，批號R0020）；PV-6000 （北京中杉金橋生物技術有限公司，批號1919D0301）。

1.4 儀器 安穩(wěn)免調碼型血糖儀和血糖試紙條（三諾傳感股份有限公司，批號820728）；高效液相色譜儀 （美國Waters 公司）；SPECTRA MAX-190 型酶標儀（美國MDC 公司）；倒置生物顯微鏡（德國Leica 公司）；DYCZ-24DN 型垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；Amersham Imager 600 成像儀（美國GE 公司）；Hitachi 7600 自動生化分析儀（日本Hitachi 公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) NRK-52E 細胞在37 ℃，含有5%CO2的潮濕空氣下，采用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細胞以1×106／孔接種于6 孔板中，培 養(yǎng) 24 h，將細胞 分為正常組（5.5 mmol／L 葡萄糖）、模型組（80 mmol／L 葡萄糖）、丹參注射液組（60、120、240 μg／mL）、氯沙坦組（1×10-5mol／L 氯沙坦）。各組細胞分別采用相應藥物處理24 h 后，收集細胞，-20 ℃保存。

2.2 糖尿病大鼠模型制備及給藥 大鼠適應性喂養(yǎng)1 周，隨機分為正常組、模型組、丹參注射液組、氯沙坦組。大鼠每日采用高脂飼料（HFD，蔗糖-豬油-奶粉-雞蛋-一般飼料＝30 ∶20 ∶4 ∶2 ∶63） 喂養(yǎng)，其中正常組以正常飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)2周后，腹腔注射STZ 溶液（50 mg／kg） 到高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠體內，以10 mmol／L 檸檬酸鹽緩沖液（pH＝4.5） 為溶劑制備STZ 溶液。3 d 后，測定大鼠血糖濃度，當血糖濃度≥16.7 mmol／L 時，可被認定為造模成功。丹參注射液組腹腔注射丹參注射液（2 mL／kg），氯沙坦組灌胃氯沙坦（20 mg／kg）。模型組和正常組大鼠分別每天腹腔注射2 mL／kg 生理鹽水，每周及時記錄各大鼠血糖水平。給藥6 周后，使用潔凈的代謝籠收集每只大鼠的尿液，并從腹主動脈收集血液樣品。大鼠處死后，摘除腎臟浸泡在10% 福爾馬林中固定過夜，脫水，包埋，制成蠟塊。石蠟切片厚度為5 μm，用于后續(xù)HE 染色和免疫組織化學檢測。

2.3 腎功能的生化指標檢測 用血糖儀測定血糖。通過Hitachi 7600 自動生化分析儀測定血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、血漿甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC），并通過將尿蛋白濃度與24 h 尿量相乘來計算24 h 尿蛋白排泄。根據(jù)制造商提供的方案，使用BCA 蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。

2.4 腎組織中AT1 表達檢測 采用免疫組化。腎組織切片進行AT1 免疫組化染色以評估丹參注射液對RAS 的影響。首先，采用PBS （10 mmol／L，pH＝7.2） 洗滌3 次，5 min／次，然后用3% H2O2處理切片5 min，將處理后的切片浸入煮沸的檸檬酸鹽緩沖溶液 （10 mmol／L，pH ＝6.0） 10～15 min。然后在室溫下用5% 牛血清白蛋白封閉30 min，加入一抗AT1 在4 ℃溫育過夜。次日，用PBS 重復洗滌3 次，根據(jù)制造商的說明將切片在聚合物檢測系統(tǒng)試劑盒中孵育20 min，并通過DAB顯色液顯色，再采用蘇木精進行細胞核染色，通過脫水，透明化和固定等步驟后，甘油封片，拍照，每組隨機選擇20 個視野，采用Image J 軟件分析陽性表達值。

2.5 腎組織及NRK-52E 細胞AT1 表達檢測 采用Western blot 法。RIPA 裂解液裂解細胞或腎組織，將裂解物離心并收集上清液。用BCA 蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。用SDS-PAGE 分離蛋白質（50 μg），然后轉移到PVDF 膜上，用5% 脫脂奶粉（含Tween-20 的Tris 緩沖鹽溶液配制） 在室溫下封閉1 min，然后孵育一抗，4 ℃過夜。次日洗滌后，加入二抗在37 ℃溫育1 min。以β-actin 為內參，使用凝膠成像儀檢測蛋白質條帶。用Image J 軟件分析條帶強度。每組條帶以正常組AT1／βactin 比值為1，其它組與之進行比較從而對各組AT1 表達進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0 軟件進行分析，數(shù)據(jù)以（） 表示。多組間比較采用單因素方差分析。以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 丹參注射液對高糖誘導的NRK-52E 細胞AT1蛋白表達的影響 與正常組比較，高糖刺激24 h后，NRK-52E 細胞AT1 蛋白表達增加（P＜0.01）；與高糖 組比較，丹參注 射液組 （120、240 μg／mL）、氯沙坦可以抑制高糖誘導的NRK-52E 細胞AT1 蛋白表達（P＜0.01）。見圖1。

圖1 丹參注射液對高糖誘導的NRK-52E 細胞AT1 蛋白表達的影響（n＝3）Fig.1 Effects of Danshen Injection on AT1 expression in high glucose-induced NRK-52E （n＝3）

3.2 丹參注射液對糖尿病大鼠蛋白尿水平及腎功能指標的影響 與正常組比較，模型組大鼠血糖、血漿TG、TC、24 h 尿蛋白排泄、Scr 和BUN 水平升高（P＜0.01），但體質量降低（P＜0.01）。給藥6 周后，與模型組比較，氯沙坦組大鼠24 h 尿蛋白排泄、Scr 和BUN 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），丹參注射液組鼠血漿TG、TC、24 h 尿蛋白排泄、Scr 和BUN 水平降低（P＜0.01），氯沙坦組和丹參注射液組對大鼠血糖差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 丹參注射液對糖尿病大鼠蛋白尿及腎功能指標的影響（n＝6～8）Tab.1 Effects of Danshen Injection on proteinuria and renal function of diabetic rats （n＝6-8）

3.3 丹參注射液對糖尿病大鼠腎組織形態(tài)及AT1 蛋白表達的影響 如圖2 所示，正常腎臟中，每個腎小球由填充毛細血管的花瓣狀分支系統(tǒng)組成，在血管內皮細胞和系膜細胞中沒有發(fā)現(xiàn)肥大或增生，無炎性細胞浸潤，基底膜也未呈現(xiàn)增厚和纖維性肥大；同時正常腎小管中，腎小管上皮細胞沒有壞死，管腔中沒有外來顆粒。模型組腎小球中出現(xiàn)炎性細胞浸潤，系膜細胞增生，毛細血管收縮和變窄，基底膜增厚和纖維化的現(xiàn)象，同時周圍伴隨有腎小管間質纖維化。丹參注射液治療后，糖尿病大鼠腎小球和皮質的結構形態(tài)與正常組大鼠相似，腎小球系膜細胞增殖明顯減少，皮質腎小管肥大、擴張，基底膜增厚情況也顯著緩解。免疫組化與Western blot 結果顯示與正常組比較，模型組腎小管中AT1 蛋白表達增加（P＜0.01）。經(jīng)丹參注射液治療6 周后，丹參注射液AT1 蛋白表達下降（P＜0.05，P＜0.01），見圖2～3。

圖2 丹參注射液對糖尿病大鼠腎組織形態(tài)及AT1 蛋白表達的影響（n＝20）Fig.2 Effects of Danshen Injection on morphology and AT1 protein expression of renal tissue in diabetic rats （n＝20）

圖3 丹參注射液對糖尿病大鼠腎組織AT1 蛋白表達的影響（n＝3）Fig.3 Effects of Danshen Injection on AT1 protein expression of renal tissue in diabetic rats （n＝3）

4 討論

糖尿病腎病的典型癥狀是尿蛋白排泄增加，而尿蛋白水平的高低與進展與終末期腎病和心血管疾病的風險分級增加有關［10］，高脂血癥也是發(fā)展為糖尿病性腎病的一種風險因素。因此，高脂飼料喂養(yǎng)大鼠并腹腔注射STZ 通常被用于構建糖尿病模型。模型組大鼠的24 h 尿蛋白排泄，BUN 和Scr水平顯著高于正常組，并且在6 周后部分萎縮性小管出現(xiàn)空泡化和狹窄的管腔，具有無序小管上皮細胞。丹參注射液治療6 周后，糖尿病大鼠24 h 尿蛋白排泄量和腎功能指數(shù)顯著降低，平衡血脂異常，但不影響血糖水平，與先前的報道一致［11］。HE 染色顯示，丹參注射液組大鼠皮質腎小管基底膜的肥厚，擴張情況有所改善。因此，降低血脂可能是丹參注射液對糖尿病腎病的治療作用之一。

RAS 是重要的體液調節(jié)系統(tǒng)，其廣泛地存在于機體組織中，如心臟、腎臟、血管壁等。在體內，當RAS 激活時，血管緊張素原在腎素的催化下轉化為血管緊張素Ⅰ（Ang Ⅰ），而后又在ACE的關鍵作用下轉化為血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ），該系統(tǒng)可參與調節(jié)腎小球與腎小管之間的平衡，降低腎小球濾過壓，影響腎血容量、血壓等［12］。近期有研究［13］表明，RAS 是糖尿病腎病主要發(fā)病機制之一，同時由于近端腎小管功能主要是通過循環(huán)和旁路分泌的Ang Ⅱ進行調節(jié)［14-15］，并且在患病狀態(tài)下誘導鈉潴留和腎小管-間質損傷或纖維化［16］，所以近端腎小管是腎臟中RAS 的主要靶組織之一。本研究發(fā)現(xiàn)體外高糖誘導的NRK-52E 細胞以及體內糖尿病大鼠皮質腎小管中的AT1 表達均與之前的報道一致［17］。研究表明，丹參注射液可以有效抑制高糖誘導的NRK-52E 細胞以及糖尿病大鼠腎小管中AT1 的表達，改善糖尿病大鼠腎臟病變及腎功能。盡管目前還沒有發(fā)現(xiàn)有關丹參是AT1 拮抗劑的報道，但是已有許多文獻表明丹參注射劑［18-19］或丹參中活性化合物［20-21］減弱了Ang Ⅱ誘導的腎臟損傷。所以丹參干預RAS 作用可能是改善糖尿病腎病作用機制之一。