基于LC-MS／MS 法分析生、炙甘草中水溶性成分

段偉萍李緣嬡鄭云楓 李存玉 陸兔林陳麗紅彭國平

（1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京210023； 2.江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇 南京210023； 3.南京中醫藥大學國家教育部中藥炮制規范化及標準化工程研究中心，江蘇 南京210023）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflataBat.或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根及根莖，是最常用的中藥之一［1-2］。歷代以來，甘草的臨床應用以生、炙甘草為主，其中炙甘草是由生甘草拌入煉蜜后加熱炮制而來［3］，具有補脾和胃、益氣復脈之功效［1］。考慮到中藥炮制功效的改變與化學成分變化存在著密切的關系，有研究采用HPLC 指紋圖譜技術對甘草蜜炙前后色譜圖進行比較，發現生、炙甘草中一些色譜峰面積存在差異［4-5］；也有文獻對甘草蜜炙前后甘草苷、甘草酸等主要指標性成分進行定量分析研究，結果顯示在炮制過程中成分出現了增減變化［6-7］。

本研究在前期研究的基礎上［8-10］，采用LCMS／MS 定性鑒別結合Marker View 軟件分析，系統解析了生、炙甘草水溶性差異成分，進一步以HPLC 梯度波長法檢測了炮制前后黃酮及三萜皂苷水溶性成分的含有量變化，以期為炙甘草的炮制及質量評價提供參考。

1 材料

AB SCIEX Triple TOFTM5600 質譜儀，電噴霧離子源（ESI），Analyst TF 1.6 和Peak View 1.2 軟件（美國AB 公司）；Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；JCS-1000 電子天平（凱豐集團有限公司）；AL204 電子分析天平（萬分之一，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；BT125D 分析天平（十萬分之一，德國賽多利斯科學儀器有限公司）。

對照品芹糖甘草苷 （JBZ180106-139，純度98.1%）、芹糖異甘草苷 （JBZ180205-813，純度98.5%）、異甘草 苷 （JBZ180314-015，純 度98.3%） 均購自南京金益柏生物科技有限公司；對照品甘草苷（111610-201607，純度93.1%）、甘草酸銨（110731-201619，純度97.0%） 均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、烏拉爾皂苷B，均由實驗室自制，經HPLC 分析，純度≥99.0%。乙腈、甲酸均為色譜純（德國Merck 公司），水為Milli-Q 超純水，其他試劑均為分析純。

6 批生甘草飲片購自內蒙古億利資源集團有限公司甘草分公司（批號20181101～20181106）。經南京中醫藥大學鑒定教研室嚴輝副教授鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。

2 方法與結果

2.1 炙甘草制備 蜜炙甘草，取煉蜜（100 g 生甘草用煉蜜25 g） 加少量水稀釋，加入生甘草飲片中拌勻，稍燜，用文火炒至深黃色、透香氣、不粘手時取出放涼。

2.2 供試品溶液制備 取生甘草或炙甘草樣品粉末（過3 號篩） 約0.5 g，精密稱定，加入水25 mL，置100 mL 圓底燒瓶，稱定質量，加熱回流1 h，放至室溫，補足減失質量，濾過，精密移取續濾液5 mL，置10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，離心（8 000 r／min，10 min） 取上清液，即得。

2.3 對照品溶液制備 取8 種對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶解，搖勻，制成芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸、烏拉爾皂苷B 質量濃度分別272.20、231.71、67.50、86.00、246.68、242.24、715.56、92.00 mg／mL 的混合 對照品溶液。

2.4 色譜條件 Hedera C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈 （A） -0.2% 甲酸（B），梯度洗脫（0～15 min，19%～25% A；15～25 min，25%～30% A；25～41 min，30%～45% A，41～ 60 min，45%～ 70% A）；體積流 量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；0～15 min 在276 nm 下檢測芹糖甘草苷和甘草苷，15～25 min 在360 nm下檢測芹糖異甘草苷和異甘草苷，25～60 min 在254 nm 下檢測22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾皂苷B；進樣量10 μL。

2.5 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正、負離子檢測模式；一級質譜條件為掃描范圍m／z50～1 500；毛細管溫度550 ℃；離子噴霧空載電壓5 500 V／-4 500 V，解簇電壓100 V／-100 V，碰撞能量10 V／-10 V，噴霧電壓5 500 V，解簇電壓100 V；二級質譜條件為掃描范圍m／z50～1 500，解簇電壓100 V／-100 V，碰撞能量35 V／-35 V，碰撞能量幅度-20 V，霧化器60 psi （1 psi ＝6.985 kPa），輔助加熱器60 psi，氣簾氣40 psi。

2.6 定性分析

2.6.1 差異性化合物分析 按“2.2” “2.3” 項下方法制備供試品和對照品溶液。采用正、負離子模式分別進行LC-MS／MS 檢測，結果顯示，在負離子模式條件下生、炙甘草中黃酮、三萜皂苷類成分的質譜響應值較高，見圖1。

圖1 生、炙甘草水溶性成分LC-MS／MS （-） TIC Fig.1 LC-MS／MS （-） TIC of water-soluble components from raw and honey-roasted licorice

依據LC-MS／MS 所測樣本保留時間、各色譜峰離子響應強度和二級質譜信息，在 Marker View1.2.1 軟件中設置質譜處理參數為最小保留時間3.0 min，最大保留時間60.0 min，最小質荷比寬度10×10-6，最小保留時間寬度6 scans，噪波閾值100，保留時間容差16 min，質荷比容差1×10-6［11］，最大峰數目500，選擇色譜峰響應值≥e3，去除同位素峰；進一步將生、炙甘草兩組LCMS／MS 總離子流圖導入Marker View 軟件中，對兩組數據進行t檢驗，獲得差異性成分的Log （Fold change） versus p-value 圖，見圖2，圖中每個散點代表一種差異性成分，其位置離X 軸越遠，代表該成分在生、炙甘草樣本中的差異性越大；以∣Log （Fold change） ∣≥0.10 為界值，篩選出了33種顯著的差異性成分，見圖1。

圖2 生、炙甘草差異性成分Log （Fold change）versus p-value 圖Fig.2 Log （Fold change） versus p-value of different components of raw and honey-roasted licorice

2.6.2 差異性成分定性鑒別 依據相關數據庫Chemspider、Scifinder 檢索以及甘草化學成分研究報道，建立甘草化學成分數據庫，進而對各主要差異性成分的質譜信息進行識別與矯正，推測化合物結構。其中，峰2，4，7，17，19，22 和24 由對照品對照進行了確認，分別為芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾皂苷B。其他成分依據已建立的目標數據庫，通過分子式匹配以及化合物質譜裂解碎片信息進行結構鑒定［12-16］。其中，甘草黃酮類成分在負離子模式下碎片信息豐富，常見特征分子量丟失 為15 Da （CH3）、18 Da （H2O）、32 Da（OCH3）、56 Da （（CH3）2CH ＝CHCH3）、132 Da（芹糖）、162 Da （葡萄糖） 等；而三萜皂苷成分在負離子模式下碎片信息較少，而在正離子質譜中可見糖取代基分子量丟失132 Da （木糖）、146 Da（鼠李糖）、162 Da （葡萄糖）、176 Da （葡糖糖醛酸），以及苷元上取代基的特征分子量丟失30 Da（C24-OH）、36 Da （2×18，C22-OH）、46 Da （C20-COOH）、60 Da （C22-OAc） 等。

以峰16 為例，在正離子模式下該化合物準分子離子峰為m／z825.425 2 ［M+H］+，確定其分子式為C42H64O16，提示該化合物可能為Uralsaponin C；此外，在峰16 的二級質譜中可見2 個連續脫去葡萄糖醛酸基的碎片離子m／z649.393 6 ［M+HC6H8O6］+和473.361 7 ［M+H-2C6H8O6］+，確定結構中有2 個葡萄糖醛酸取代基，同時從苷元離子連續脫去2 分子H2O 可見碎片離子m／z437.361 7［M+H-2C6H8O6-2H2O］+，表明苷元結構22 位上有羥基取代，以上結構鑒定信息與Uralsaponin C 相一致，最終峰16 鑒定為Uralsaponin C。依據以上差異性成分定性鑒定方法，共推測鑒定了30 種成分，包括12 種黃酮及18 種三萜皂苷，相關質譜信息及化合物結構分別見表1、圖3。

表1 甘草蜜炙前后差異性成分定性鑒別Tab.1 Qualitative identification of the differential ingredients between raw and honey-roasted licorice

2.7 含有量變化分析 為了更準確地評價炮制前后主要特征差異性成分的含有量變化，依據LCMS／MS 數據及Marker View 軟件分析，選擇了4 種黃酮類成分為芹糖甘草苷 （Q-LQ）、甘草苷（LQ）、芹糖異甘草苷（Q-ILQ）、異甘草苷（ILQ）及4 個三萜皂苷類成分為22β-乙酰甘草酸（22β-AGA）、甘草皂苷G2 （LS-G2）、甘草酸 （GA）、烏拉爾皂苷B （US-B） 為指標，采用HPLC 梯度波長進行了含有量測定與對比分析，見圖4。

圖3 差異性成分結構Fig.3 Chemical structure of differential components

2.7.1 方法學考察

2.7.1.1 精密度試驗 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項色譜條件下重復進樣6次，測得4 種黃酮和4 種三萜皂苷的色譜峰保留時間和峰面積RSD 均小于2.01%，表明儀器精密度良好。

2.7.1.2 穩定性試驗 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項色譜條件下，分別于0、2、4、6、12、24 h 進樣，測得4 種黃酮和4種三萜皂苷的色譜峰保留時間和峰面積RSD 均小于2.44%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.7.1.3 重復性試驗 精密稱定同一批次樣品6份，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項色譜條件下分別進樣，測得4 種黃酮和4種三萜皂苷的色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于1.80%，表明該方法重復性良好。

圖4 各成分HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.7.1.4 線性關系考察 取8 種對照品混合溶液適量，逐級稀釋成系列濃度的混合對照品溶液，分別吸取10 μL，在“2.4” 項色譜條件下進樣，以峰面積為縱坐標（Y），各對照品質量濃度為橫坐標（X），進行回歸，結果見表2。表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7.2 差異性特征成分定量分析 分別取6 批生甘草及6 批炙甘草，按“2.2” “2.4” 項下方法分別制備供試品溶液并進行測定，以標準曲線計算8種成分的含有量，采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行單因素方差分析。結果顯示，生甘草在蜜炙后芹糖甘草苷、甘草苷、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾皂苷B 成分均下降 （P＜0.01）；異甘草苷含有量升高（P＜0.05），芹糖異甘草苷變化無統計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 生、炙甘草中差異性特征成分含有量比較Fig.5 Comparison of different characteristic components in raw and honey-roasted licorice

考慮到生甘草炮制過程中加入的煉蜜會對炙甘草中成分的實際含有量產生影響，參考文獻［17］以每100 g 炙甘草中含干燥蜂蜜量12 g 計，扣除蜂蜜質量計算炙甘草各成分實際含有量。結果顯示，黃酮類成分芹糖異甘草苷和異甘草苷平均含有量分別上升5.11%、25.94%，甘草苷和芹糖甘草苷含有量分別下降21.77%、18.43%，而甘草酸等4 種三萜皂苷成分平均含有量均出現下降，幅度在10.07%～16.69%，結果見表3。

表3 生、炙甘草中各成分含有量變化（，n＝6，mg·g-1）Tab.3 Content change of various constituents in raw and honey-roasted licorice （，n＝6，mg·g-1）

表3 生、炙甘草中各成分含有量變化（，n＝6，mg·g-1）Tab.3 Content change of various constituents in raw and honey-roasted licorice （，n＝6，mg·g-1）

3 討論

傳統中醫認為，甘草經蜜炙后功效“由清轉補”，補脾和胃、益氣復脈功效增強，有研究表明，甘草蜜炙后補脾益氣藥效作用增強，且明顯優于生甘草及清炒品［18］。本實驗通過開展蜜炙對甘草化學成分的影響研究，發現生、炙甘草水溶性化學成分存在一定的差異，具體表現為，甘草蜜炙后芹糖異甘草苷和異甘草苷含有量上升，芹糖甘草苷和甘草苷含有量下降，基于黃酮成分結構轉化規律，應為二氫黃酮成分芹糖甘草苷和甘草苷在炮制加熱過程中B 環開環轉化為芹糖異甘草苷和異甘草苷所致，有文獻表明異甘草苷等甘草黃酮類成分具有抗心律失常［19-21］、保護胃黏膜［22］等作用。炙甘草“益氣復脈” 功效，主要表現為增強抗心律失常作用，因此異黃酮類成分的轉化及含有量提升，可能與炙甘草益氣復脈功效的增強有關。

考慮甘草生、炙品在傳統臨床使用、配方顆粒和經典名方開發均以水為溶劑進行提取或制備，且生、炙甘草中主要活性成分黃酮和皂苷均具有一定的水溶性，因而本實驗選擇水回流提取的方式。此外，在含有量測定過程中采用二極管陣列檢測器對檢測波長進行了考察，結果顯示芹糖甘草苷和甘草苷等二氫黃酮類成分在276 nm 波長條件下有較大吸收，芹糖異甘草苷和異甘草苷成分在360 nm 波長條件下吸收較強，而三萜皂苷類成分如甘草酸等在254 nm 波長吸收強度最強，因此本實驗選擇了梯度波長進行檢測。

本實驗研究方法能夠快速、系統地分析甘草蜜炙前后黃酮及三萜皂苷的成分變化，而差異性組分的解析可為炙甘草炮制及質量標準研究提供一定的依據。但甘草中除了黃酮及三萜皂苷類成分外，還含有多糖及寡糖類組分［23］，輔料蜂蜜也含有果糖、葡萄糖等成分［24］，在甘草蜜炙過程中糖類組分如何發生變化，尚待后續作進一步探索。