不同走油程度苦杏仁“電子鼻” 氣味與止咳藥效的相關(guān)性分析

曹光昭，陳慧榮，劉玢清，姚月保，閆永紅?，鄒慧琴?

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102； 2.北京海金格醫(yī)藥科技股份有限公司，北京100161）

中藥在貯藏過(guò)程中，受自身性質(zhì)以及外界條件的影響，常發(fā)生物理或化學(xué)變化，這些變化時(shí)常伴隨著藥材的變質(zhì)。走油是中藥材貯藏過(guò)程中易發(fā)生的變質(zhì)現(xiàn)象之一，又稱泛油，是指中藥材內(nèi)含的脂肪、揮發(fā)油、糖類等成分在特殊的自然因素作用下外溢，表面呈現(xiàn)油潤(rùn)的狀態(tài)，質(zhì)地發(fā)生明顯變化，外觀色澤加深或伴有哈喇味等現(xiàn)象。藥材走油不僅導(dǎo)致油脂成分損失，還會(huì)引起變色和變質(zhì)［1］，使經(jīng)濟(jì)遭受損失，更嚴(yán)重的則會(huì)影響藥材質(zhì)量和臨床療效，甚至產(chǎn)生毒性［2］。

苦杏仁是常用大宗中藥，是易走油變質(zhì)的典型代表。傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，走油后的苦杏仁胚乳顏色加深至黃棕色，或伴有哈喇味［3］。大多數(shù)中藥材都具有固定的氣味，中藥的氣味與內(nèi)在化學(xué)物質(zhì)密切相關(guān)，能反映藥物的內(nèi)在本質(zhì)，成為中藥外在質(zhì)量表現(xiàn)［4］，更有學(xué)者指出色變則味變、味變則質(zhì)變［5］。由此可見(jiàn)，感官氣味對(duì)苦杏仁質(zhì)量評(píng)價(jià)至關(guān)重要。

經(jīng)驗(yàn)鑒別以眼看、手摸、鼻聞、口嘗等方法對(duì)飲片的性狀進(jìn)行鑒別［6］。傳統(tǒng)的人體感官評(píng)價(jià)，其檢測(cè)結(jié)果將受到感官差異和檢測(cè)環(huán)境的影響，主觀性強(qiáng)，缺乏客觀量化指標(biāo)，在大批量工業(yè)生產(chǎn)中可操作性差［7］，尤其是對(duì)中藥氣味的鑒別。因此，有必要結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)方法構(gòu)建中藥氣味客觀化和數(shù)字化的方法，實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用，進(jìn)一步補(bǔ)充和完善中藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)體系［7］。

為此本研究引入廣泛應(yīng)用于許多行業(yè)的電子鼻，電子鼻能夠根據(jù)氣味特征區(qū)分不同藥材粉末［8-9］，同一藥材不同品種［10］、不同炮制規(guī)格［11］、不同商品規(guī)格［12］、不同產(chǎn)地［13］、不同儲(chǔ)存時(shí)期的鑒別［14］。本研究通過(guò)電子鼻對(duì)苦杏仁氣味進(jìn)行測(cè)定，得出定量描述的數(shù)值。電子鼻，又被稱作人工嗅覺(jué)系統(tǒng)，其工作原理模仿了人類對(duì)氣味的識(shí)別機(jī)制［15］。

苦杏仁性苦，微溫，歸肺、大腸經(jīng)，有止咳平喘、潤(rùn)腸通便之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為苦杏仁有鎮(zhèn)咳平喘作用、殺蟲(chóng)作用［16］、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腎間質(zhì)纖維化、抗肺纖維化、抗高氧誘導(dǎo)肺損傷、免疫抑制、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗?jié)兊茸饔茫?7］。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于止咳藥效報(bào)道相對(duì)較多，認(rèn)為苦杏仁止咳的有效成分苦杏仁苷在人體內(nèi)分解，產(chǎn)生微量的氫氰酸，氫氰酸可對(duì)呼吸中樞產(chǎn)生抑制作用，使呼吸運(yùn)動(dòng)趨于平緩，從而起到鎮(zhèn)咳平喘的作用［18］。本研究通過(guò)基于氨水刺激的咳嗽小鼠模型，以不同走油程度的苦杏仁為載體，研究苦杏仁氣味與止咳藥效的相關(guān)性，以探討走油對(duì)苦杏仁藥材質(zhì)量的影響，以期為藥材感官氣味的數(shù)字化及其應(yīng)用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)相關(guān)領(lǐng)域提供參考。

1 材料

α-FOX3000 氣味指紋分析儀（法國(guó)Alpha M.O.S 公 司）；BSA124S 電子分析天平 （德 國(guó)Sartoius 公司）；ZN-02 小型粉碎機(jī)（北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司）；藥典篩，YLS-8 A 多功能誘咳引喘儀（上海欣軟信息科技有限公司）。氨水（分析純，北京化工廠）。

KM 小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量20～22 g，北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)SCXK（京） 20160002。

苦杏仁，2017 年12 月購(gòu)入（燀、炒2 個(gè)炮制規(guī)格），本實(shí)驗(yàn)選取的樣品分別代表未走油、輕微走油、完全走油的苦杏仁樣品，樣品依據(jù)傳統(tǒng)性狀鑒定，將人工評(píng)價(jià)得分聚類分析后，將苦杏仁分為4 個(gè)等級(jí)，分別代表不同走油程度的苦杏仁樣品，Ⅰ級(jí)，未走油、Ⅱ級(jí)，輕度走油、Ⅲ級(jí)，中度走油、Ⅳ級(jí)，重度走油。炒品0 號(hào)、燀品0 號(hào)被分在Ⅰ級(jí)，炒品5 號(hào)、燀品5 號(hào)被分在Ⅱ級(jí)，炒品11號(hào)、燀品11 號(hào)被分在Ⅳ級(jí)，以上樣品能較為全面的代表不同走油程度的苦杏仁樣品。因此，選取這6 種樣品進(jìn)行止咳藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，樣品信息見(jiàn)表1。所有樣品均經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系閆永紅教授鑒定為正品。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 苦杏仁氣味測(cè)定方法

2.1.1 氣味測(cè)定工具 實(shí)驗(yàn)所用儀器α-FOX3000氣味指紋分析儀由主機(jī)和自動(dòng)頂空進(jìn)樣儀組成，其中，主機(jī)內(nèi)安裝了12 根金屬氧化物傳感器，用于檢測(cè)揮發(fā)性氣體，即從S1 到S12，具有不同的檢測(cè)靈敏度，見(jiàn)表2。

2.1.2 樣品制備 將苦杏仁樣品粉碎過(guò)2 號(hào)篩，稱取0.3 g，裝入頂空進(jìn)樣瓶，壓蓋密封。

2.1.3 氣味測(cè)定條件 孵化時(shí)間600 s，孵化溫度45 ℃，樣品震蕩速度250 r／s，進(jìn)樣量2 500 μL，載氣為壓縮空氣，體積流量150 mL／min，數(shù)據(jù)采集時(shí)間120 s，數(shù)據(jù)采 集周期1 s，吹掃時(shí) 間600 s。

2.2 提取液制備 取炒苦杏仁、燀苦杏仁粗粉12 g，精密稱定，分別加水96 mL，浸泡30 min，回流提取30 min，濾過(guò)，藥渣加水96 mL，回流提取20 min，濾過(guò)，合并提取液，離心，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃減壓濃縮至適量，定量移入100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻備用［18］。

表2 金屬氧化傳感器及檢測(cè)范圍Tab.2 Metal oxidation sensor and detection range

2.3 小鼠氨水引咳法 20～22 g 昆明種小鼠，雌雄各半，按體質(zhì)量、性別均衡隨機(jī)分為空白對(duì)照組、燀品Ⅰ-D-0 號(hào)組、燀品Ⅱ-D-5 號(hào)組、燀品Ⅳ-D-11 號(hào)組、炒品Ⅰ-C-0 號(hào)組、炒品Ⅱ-C-5 號(hào)組、炒品Ⅳ-C-11 號(hào) 組，每 組 10 只。給藥組 按0.2 mL／10 g灌胃給予相應(yīng)濃度的不同藥物，給藥劑量均1.2 g／kg。空白對(duì)照組給予生理鹽水0.2 mL／10 g灌胃，每只鼠間隔2 min 給藥，連續(xù)給藥7 d，最后1 d 于給藥后3 h 逐一放入YLS-8 A多功能誘咳引喘儀透明有機(jī)玻璃容器中，超聲霧化器噴入12.5%氨水，預(yù)先設(shè)定噴霧時(shí)間為20 s，相鄰2 個(gè)刺激時(shí)間對(duì)數(shù)差為0.1。每組第1 只小鼠刺激時(shí)間均為20 s，刺激完成后觀察小鼠1 min 內(nèi)典型咳嗽次數(shù)（以小鼠腹肌收縮或縮胸，同時(shí)張大嘴為典型咳嗽），若≥3 次，記為有咳嗽 （+）；若＜3，記為無(wú)咳嗽（-）。若前一只“有咳嗽”，后一只用低一級(jí)時(shí)間刺激；反之，用高一級(jí)時(shí)間刺激。根據(jù)公式計(jì)算小鼠半數(shù)引咳時(shí)間（EDT50）、R 值。

EDT50＝log-1×cn＝10c／n。公式中n為動(dòng)物數(shù)，c為rx值的總和，r為每劑量組的動(dòng)物數(shù)，x為劑量（即噴霧時(shí)間） 的對(duì)數(shù)。止咳藥效用R表示，R大于等于1.5 者有顯著鎮(zhèn)咳作用，R大于等于1.3 者認(rèn)為有鎮(zhèn)咳作用。計(jì)算方法見(jiàn)表3。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS9.4 進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，選用相關(guān)性分析的Pearson 相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)和Spearman 相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法對(duì)苦杏仁止藥效與12 根傳感器的最大響應(yīng)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 序貫法測(cè)定EDT50計(jì)算例Tab.3 A calculation example of EDT50determination by sequential method

3 結(jié)果

3.1 氣味測(cè)定 按“2.1” 項(xiàng)下方法，對(duì)苦杏仁樣品進(jìn)行氣味的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1、表4。從圖中可以看出傳感器響應(yīng)值的變化有一個(gè)逐漸升高、達(dá)到峰值回落，而后趨于平坦的過(guò)程，這是由于在頂空進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)入傳感器通道的樣品揮發(fā)性物質(zhì)濃度由一開(kāi)始不斷升高到相對(duì)降低再到動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

圖1 電子鼻傳感陣列對(duì)各樣品氣味的響應(yīng)圖Fig.1 Response chart of Electronic nose sensor array to various samples

表4 12 根傳感器的最大響應(yīng)值Tab.4 Maximum response of twelve sensors

表5 不同走油程度燀品苦杏仁組間比值Tab.5 Inter-group ratio of blanching products with different oil dependence

表6 不同走油程度炒品苦杏仁組間比值Tab.6 Inter-group ratio of stir-frying products with different oil dependences

3.2 鎮(zhèn)咳藥效 具體結(jié)果見(jiàn)表5～6。結(jié)果表明，燀品、炒品隨著走油程度的不斷加深，止咳作用均逐漸減弱。燀品Ⅰ-D-0 組與對(duì)照組的比值小于炒品Ⅰ-C-0 與對(duì)照組的比值，表明未走油的炒品止咳作用大于未走油的燀品。燀品Ⅰ-D-0 組、燀品Ⅱ-D-5 組、炒品Ⅰ-C-0 組和炒品Ⅱ-C-5 組與對(duì)照組相比，比值均大于1.5，表明未走油的燀品、炒品和輕微走油的燀品、炒品均具有顯著的止咳作用；燀品Ⅳ-D-11 組與對(duì)照組相比，比值小于1.3，表明完全走油的燀品不具有止咳作用；炒品Ⅳ-C-11 組與對(duì)照組相比，比值大于1.3，表明完全走油的炒品具有止咳作用。炒品Ⅰ-C-0 組、燀品Ⅰ-D-0組分別與炒品Ⅳ-C-11 組、燀品Ⅳ-D-11 組相比，均表現(xiàn)出了顯著地止咳作用，炒品Ⅱ-C-5 組與炒品Ⅳ-C-11 組相比，也表現(xiàn)出了顯著地止咳作用。3.3 數(shù)據(jù)分析 將苦杏仁止咳藥效分別與電子鼻12 根傳感器的最大響應(yīng)值相關(guān)聯(lián)，使用SAS 軟件做相關(guān)分析，結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明，傳感器S1、S7、S8、S11、S12 和苦杏仁止咳作用之間不存在顯著相關(guān)，說(shuō)明傳感器S1、S7、S8、S11、S12 和止咳作用之間表現(xiàn)不出量效關(guān)系。苦杏仁的止咳作用與電子鼻傳感器S3、S4、S6 在0.01 水平上有顯著相關(guān)關(guān)系，與S2、S5、S9、S10 在0.05 水平上有顯著相關(guān)關(guān)系。從相關(guān)系數(shù)上可以看出，苦杏仁的止咳作用與傳感器S2、S3、S4、S5、SX6 呈負(fù)相關(guān)，即在一定程度上，S2、S3、S4、S5、S6 傳感器響應(yīng)值越高，苦杏仁的止咳作用效果越差；苦杏仁的止咳藥效與傳感器S9、S10 呈正相關(guān)，即在一定程度上，S9、S10 傳感器響應(yīng)值越高，苦杏仁的止咳作用效果越好。

表7 止咳藥效與12 傳感器的相關(guān)系數(shù)Tab.7 Correlation coefficient of antitussive effects and twelve sensors

4 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明傳統(tǒng)性狀分類結(jié)果中，質(zhì)量較優(yōu)的樣品止咳作用優(yōu)于質(zhì)量一般樣品優(yōu)于質(zhì)量較差樣品。隨著苦杏仁走油程度的加深，苦杏仁止咳藥效逐漸減弱，推測(cè)苦杏仁走油過(guò)程中，苦杏仁苷的含有量在逐漸降低［19］。在苦杏仁質(zhì)量最優(yōu)時(shí)，炒品藥效優(yōu)于燀品。完全走油的炒品還具有止咳藥效，推測(cè)是苦杏仁完全走油后，樣品中尚有苦杏仁苷。走油后的苦杏仁雖具有止咳作用，但還能否藥用需進(jìn)行后續(xù)研究。

將止咳作用結(jié)果同顏色測(cè)量結(jié)果結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)6 份樣品與傳感器S2、S3、S4、S5、S6、S9、S10 響應(yīng)值存在差異，可根據(jù)此結(jié)果優(yōu)化傳感器陣列。傳感器S2、S3、S4、S5、S6 響應(yīng)值越大，傳感器S9、S10 響應(yīng)值越小，藥材的感官氣味（哈喇味） 越重，苦杏仁止咳效果越差。S3、S4、S6傳感器與止咳作用在0.01 水平上有顯著相關(guān)性，因此在用電子鼻測(cè)定氣味時(shí)應(yīng)著重關(guān)注傳感器的響應(yīng)值。S3、S4、S6 傳感器響應(yīng)值越大，止咳效果越差。且性狀鑒別認(rèn)為質(zhì)量較優(yōu)的樣品止咳作用也較好。苦杏仁樣品哈喇味越嚴(yán)重，止咳作用有越差的趨勢(shì)。

本研究表明，苦杏仁氣味同止咳作用存在一定相關(guān)性，苦杏仁氣味與S3、S4、S6 傳感器聯(lián)系密切。因?yàn)镾3、S4、S6 傳感器對(duì)乙醇、氨氣、有機(jī)胺類、丙烷、丁烷比較敏感，而且相關(guān)文獻(xiàn)表明［20］，苦杏仁的揮發(fā)性成分中含有醇類的紫蘇醇、苯甲醇、4-萜烯醇、2-己 基-1-癸 醇、3，7，11，15-四甲基已烯-1-醇；胺類的3，5-二甲基金剛烷-1-基胺、N-甲 基-N-甲基苯 甲酰胺；烷烴類 的heptane，2，2，4，6，6-pentamethyl-（2，2，4，6，6-五甲基庚烷）、十二烷、四十三烷、正二十烷、四十四烷等成分，因此推測(cè)這些成分可能與苦杏仁走油之后產(chǎn)生的哈喇味有關(guān)，課題組后期將對(duì)苦杏仁的揮發(fā)性成分進(jìn)行進(jìn)一步的定量分析，對(duì)以上物質(zhì)與S3、S4、S6 傳感器之間的規(guī)律進(jìn)行研究。

電子鼻的應(yīng)用說(shuō)明可以使苦杏仁信息數(shù)字化，以期為將電子鼻推廣應(yīng)用于其他藥材的氣味測(cè)定提供理論依據(jù)。因本研究中選取的苦杏仁樣本量較少，未能建立止咳藥效的預(yù)測(cè)模型，后期的研究將以該實(shí)驗(yàn)中篩選出的傳感器為基礎(chǔ)，增加樣本量，建立止咳藥效的預(yù)測(cè)模型。