實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法鑒別川貝母摻偽

楊 健 李 靖 薛維娜王愛民何 彬王永林李勇軍席曉嵐?劉 亭?

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)，民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥衛(wèi)生管理學(xué)院，貴州 貴陽550025； 4.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽550025）

川貝母Fritillariae CirrhosaeBulbus 是百合科貝母屬川貝母Fritillaria cirrhosaD.Don、甘肅貝母Fritillaria przewalskiiMaxim.、暗紫貝 母Fritillaria unibracteataHsiao et K.C.Hsia、瓦布貝母Fritillaria unibracteataHsiaoet K.C.Hsia var.wabuensis （S.Y.Tang et S.C.Yue） Z.D.Liu，S.Wang et S.C.Chen、梭砂貝母Fritillaria delavayiFranch.或太白貝母Fritillaria taipaiensisP.Y.Li 的干燥鱗莖［1-2］，有化痰止咳、清熱潤(rùn)肺、散結(jié)消癰之功效［3-5］。由于川貝母的藥用價(jià)值高、療效顯著、市場(chǎng)需求量大，故常有用其他貝母類藥材混充川貝母的現(xiàn)象，如浙貝母、平貝母、伊貝母、湖北貝母等。

目前川貝母鑒別中最常用且最準(zhǔn)確的是由2015 年版《中國(guó)藥典》 收錄的PCR-RFLP 法，該法是一種鑒別單個(gè)川貝母真?zhèn)蔚姆椒ǎ⒉荒芊磻?yīng)樣品的整體情況，不能準(zhǔn)確反應(yīng)樣品的摻偽程度［6-7］。按制藥企業(yè)一次購(gòu)買川貝母200 kg 以上計(jì)算，按2015 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定［8-9］，至少需要抽取25～50 g 左右川貝母樣品進(jìn)行檢測(cè)，需要進(jìn)行50～100 次PCR-RFLP 反應(yīng)，工作量較大，耗時(shí)較長(zhǎng)且成本高昂。所以在生產(chǎn)中，常常只取10 g左右川貝母進(jìn)行真?zhèn)舞b別，但是這種取樣方法并不能反應(yīng)樣品的整體情況，不能準(zhǔn)確反應(yīng)樣品的摻偽程度。尤其是在臨床上，川貝母常以粉末形式使用，這更方便了不法分子使用混偽品冒充或摻入川貝母；而混合樣品由于DNA 不純，很難用藥典PCR-RFLP 法來檢測(cè)混合粉末樣品中的摻偽程度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法是一種基于特異性基因序列的快速準(zhǔn)確、靈敏度高的定性定量方法［10］。本研究利用川貝母ITS1 區(qū)序列的特點(diǎn)［11-13］，設(shè)計(jì)了2 條特異性鑒別真川貝母的正向引物以及2 條特異性鑒別常見的偽川貝母的正向引物，配合設(shè)計(jì)的反向引物分別組成引物對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以期開發(fā)一種可檢測(cè)川貝母樣品摻偽程度的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。

1 材料

DNA 提取試劑盒 （貨號(hào)AP-MN-MS-GDNA-50） 購(gòu)自美國(guó)Axygen 公司；GelRed （貨號(hào)41003）購(gòu)自美國(guó)Biotium 公司；DNA Marker Ⅰ （貨號(hào)MD101） 和50 bp DNA Ladder （貨號(hào)MD108） 均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；SYBR 熒光定量PCR 試劑（貨號(hào)RR820Q）、6×Loading Buffer （貨號(hào)9156） 均購(gòu)自日本Takara 公司；KOD-plus 酶（貨號(hào)F0 934 K） 均購(gòu)自日本Toyobo 公司；Sma I酶（貨號(hào)ER0661） 購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司。G：BOX ChemiXL1.4 型凝膠成像儀（英國(guó)Syngene 公司）；CFX-96 型熒光定量PCR 儀、PowerpacTMBasic 電泳儀型（美國(guó)BIO-RAD 公司）；Fresco 17型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）；TMC 振蕩恒溫孵育器（合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司）。PCR 引物由英濰捷基（上海） 貿(mào)易有限公司合成，信息見表1。

對(duì)照品川貝母（批號(hào)121000-201108）、平貝母（批號(hào)120924-201410）、伊貝母（批號(hào)120929-201005）、湖北貝母（批號(hào)120962-201005）、浙貝母（批號(hào)120972-201405） 均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。市售川貝母10 批，分別于貴陽市各藥店購(gòu)買，標(biāo)號(hào)依次為CBM-1 至CBM-10。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 方法

2.1 基因組DNA 提取 稱取樣品粉末0.5 g 于5 mL 離心管中，按基因組提取試劑盒說明提取DNA，最后加入20 μL 雙蒸水洗脫，得到樣品基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR-RFLP 反應(yīng) 引物使用PCR-RFLP 引物，按2015 年版《中國(guó)藥典》 方法進(jìn)行操作。30 μL PCR 體系為 10 × PCR 緩沖液 3 μL，MgCl2（25 mmoL／L ） 2.4 μL，dNTP （10 mmoL／L ）0.6 μL，正向引物（30 μmoL／L） 0.5 μL，反向引物（30 μmoL／L） 0.5 μL，基因組DNA 200 ng，KOD-plus 酶（5 U／μL） 0.2 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)足至30 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性4 min；擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）；72 ℃延伸5 min。

取PCR 反應(yīng)液置于1.5 mL 離心管中，利用SmaⅠ酶對(duì)其進(jìn)行酶切。反應(yīng)體系為10×酶切緩沖液2 μL，PCR 反應(yīng)液6 μL，SmaⅠ酶（10 U／μL）0.5 μL，無菌水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)在30 ℃水浴中進(jìn)行2 h。樣品利用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓5 V／cm；電泳時(shí)間30 min，使用凝膠成像儀拍照并保存圖像。

2.3 熒光定量PCR 反應(yīng) 2×SYBR PCR 緩沖液2 μL，正向引物（10 μmoL／L） 0.3 μL，反向引物（10 μmoL／L） 0.3 μL，基因組DNA 200 ng，無菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。94 ℃預(yù)變性4 min；擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括以下步驟，94 ℃ 30 s，68 ℃30 s，讀板獲取熒光信息。

2.4 考察引物對(duì)1～4 鑒別川貝母的準(zhǔn)確性

2.4.1 鑒別川貝母、平貝母、湖北貝母、浙貝母、伊貝母 取川貝母、平貝母、湖北貝母、浙貝母和伊貝母對(duì)照品的基因組DNA。分別用引物對(duì)1～4，按“2.3” 項(xiàng)下方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。電泳條件為恒壓，電壓為5 V／cm；電泳時(shí)間30 min。結(jié)果與PCR-RELP 法進(jìn)行比較。

2.4.2 鑒別市售川貝母 取市售川貝母樣品（CBM-1 至CBM-10） 各50 g，依次用滅菌水、75%乙醇和雙蒸水清洗，置于超凈工作臺(tái)晾干，轉(zhuǎn)至另一個(gè)研缽中，研磨成細(xì)粉。按“2.1” 項(xiàng)下方法提取基因組DNA。分別用引物對(duì)1～4，按“2.3” 項(xiàng)下方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。電泳條件為恒壓，電壓為5 V／cm；電泳時(shí)間為30 min。結(jié)果與PCR-RELP法進(jìn)行比較。

2.5 川貝母樣品摻偽程度檢測(cè)

2.5.1 對(duì)照品混合樣品制備 取川貝母、浙貝母、平貝母、伊貝母和湖北貝母對(duì)照品（粉末），分別按表2 混合川貝母真品和偽品。

2.5.2 市售樣品混合樣品制備 分別取市售川貝母樣品中鑒別為川貝母真品和川貝母?jìng)纹返臉悠罚谘欣徶醒心コ杉?xì)粉，分別按表2 混合川貝母真品和偽品。

2.5.3 PCR 檢測(cè) 利用真川貝母鑒別引物（引物1 或引物2），進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，得到Ct值（Ct真）［14］；利用偽川貝母鑒別引物（引物3或引物4） 配合反向引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，得到Ct值（Ct偽），則川貝母混合樣品的摻偽比例＝1／ ［（1+2-（Ct真-Ct偽）］ × 100%。

進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)時(shí)，引物對(duì)1 和引物對(duì)3 配合使用，引物對(duì)2 和引物對(duì)4 配合使用。

表2 川貝母和偽品混合比例Tab.2 Mixed proportion of F.Cirrhosae and counterfeit

3 結(jié)果

3.1 PCR-RFLP 反應(yīng)鑒別 利用PCR-RFLP 引物，按《中國(guó)藥典》 方法對(duì)川貝母、平貝母、湖北貝母、浙貝母和伊貝母對(duì)照品進(jìn)行PCR-RFLP 反應(yīng)，結(jié)果見圖1。經(jīng)SmaⅠ酶切后，川貝母對(duì)照品在100～250 bp 之間出現(xiàn)了2 條酶切條帶，與藥典規(guī)定相符；浙貝母、平貝母、伊貝母和湖北貝母對(duì)照品在100～250 bp 之間沒有酶切條帶，均符合藥典。

圖1 各對(duì)照品PCR-RFLP 反應(yīng)電泳圖譜Fig.1 PCR-RFLP electrophoresis of various reference samples

3.2 PCR 鑒別結(jié)果 利用特異性引物對(duì)1～4，對(duì)川貝母對(duì)照品的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。在引物對(duì)1～2 的作用下，川貝母對(duì)照品擴(kuò)增出了200 bp 左右的條帶，而引物對(duì)3～4 不能引發(fā)PCR 擴(kuò)增，符合理論預(yù)期。這一檢測(cè)結(jié)果與藥典PCR-RFLP 結(jié)果相符，表明當(dāng)PCR 反應(yīng)模板為川貝母真品時(shí)，本研究所述的引物對(duì)1～2 可以引發(fā)PCR 擴(kuò)增，得到200 bp 左右的產(chǎn)物；而引物對(duì)3、4 不能引發(fā)PCR 擴(kuò)增。

圖2 引物對(duì)1～4 對(duì)川貝母對(duì)照品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的電泳圖譜Fig.2 PCR electrophoresis of primers pairs 1-4 of F.Cirrhosae reference samples

圖3 引物對(duì)1～4 對(duì)各樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification of various samples with primers 1-4

3.3 引物對(duì)1～4 鑒別 利用特異性引物對(duì)1～4，對(duì)浙貝母、平貝母、伊貝母、湖北貝母的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果見圖3。當(dāng)PCR 反應(yīng)模板為川貝母?jìng)纹罚ㄕ阖惸浮⑵截惸浮⒁霖惸负秃必惸福?時(shí)，本研究所述的引物對(duì)1～2 不能引發(fā)PCR 擴(kuò)增；本研究所述的引物對(duì)3～4 能引發(fā)PCR擴(kuò)增，得到200 bp 左右的產(chǎn)物。

3.4 PCR-RFLP 反應(yīng)鑒別市售川貝母 按2015 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定，川貝母真品經(jīng)SmaⅠ酶切后，產(chǎn)生2 條新的條帶且大小在100～250 bp 之間。由酶切后的電泳圖見圖4，CBM-1、CBM-2、CBM-5、CBM-6、CBM-8、CBM-10 6 批藥材和川貝母對(duì)照品一樣，在100～250 bp 之間有2 條帶，表明均為真品；而CBM-3、CBM-4、CBM-7、CBM-9 4 批藥材和平貝母對(duì)照品一樣沒有條帶，表明均為偽品。

3.5 引物對(duì)1～4 鑒別市售川貝母 根據(jù)本研究所得結(jié)論，川貝母真品經(jīng)引物對(duì)1～2 PCR 擴(kuò)增后，應(yīng)該出現(xiàn)一條200 bp 左右的條帶；而川貝母?jìng)纹方?jīng)引物對(duì)3～4 PCR 擴(kuò)增后，應(yīng)該出現(xiàn)一條200 bp左右的條帶。結(jié)果見圖5，市售川貝母樣品經(jīng)引物對(duì)1～4 擴(kuò)增后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與“3.4” 項(xiàng)一致，表明本研究所設(shè)計(jì)的特異性引物可用于鑒別川貝母真?zhèn)巍?/p>

圖4 PCR-RFLP 法鑒別市售川貝母的電泳圖譜Fig.4 Electrophoresis of F.Cirrhosae samples identified by PCR-RFLP

圖5 市售川貝母樣品熒光定量PCR 產(chǎn)物電泳圖譜Fig.5 Electrophoresis of PCR samples of F.Cirrhosae

3.6 熒光定量PCR 法鑒別川貝母及常見偽品的混合樣品摻偽 川貝母對(duì)照品及常見川貝母?jìng)纹穼?duì)照品的混合樣品經(jīng)真川貝母鑒別引物對(duì)1～2 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增得到Ct值記為Ct真；經(jīng)偽川貝母鑒別引物對(duì)3～4 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增得到Ct值記為Ct偽，經(jīng)計(jì)算得到相應(yīng)的混合樣品的摻偽比例，結(jié)果見表3～4。結(jié)果顯示，計(jì)算所得川貝母摻偽比例與實(shí)際的偽品含有量接近。

3.7 熒光定量PCR 法檢測(cè)市售川貝母混合樣品摻偽 市售川貝母混合樣品經(jīng)引物對(duì)1～4 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增后，分別得到Ct真和Ct偽，經(jīng)計(jì)算得到相應(yīng)的混合樣品的摻偽比例，結(jié)果見表5。計(jì)算所得川貝母摻偽比例與實(shí)際的偽品含有量接近。

表3 引物對(duì)1～3 混合川貝母樣品的摻偽程度檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Degree results of detecting the adulteration of mixed samples by primers 1-3

表4 引物對(duì)2～4 檢測(cè)混合川貝母樣品的摻偽程度結(jié)果Tab.4 Degree results of detecting the adulteration of mixed samples by primers 2-4

表5 引物對(duì)1、3，2、4 檢測(cè)市售川貝母混合樣品摻偽程度結(jié)果Tab.5 Degree results of detecting the adulteration of mixed samples by primers 1，3 and primers 2，4

4 討論

本研究設(shè)計(jì)的真川貝母鑒別引物以川貝母ITS1 區(qū)的第75 位堿基“C” 為3′未端，偽川貝母鑒別引物以偽川貝母ITS1 區(qū)的第75 位堿基“T”為3′未端［11］。2 種引物的3′端的第3 個(gè)堿基處，都引入了堿基錯(cuò)配，增加了鑒別的特異性和準(zhǔn)確性。本研究所述的引物對(duì)1～4 可以用于鑒別川貝母真品和浙貝母、平貝母、伊貝母、湖北貝母等常見川貝母?jìng)纹罚瑴?zhǔn)確率與2015 年版《中國(guó)藥典》收錄的PCR-RELP 法一致，不會(huì)出現(xiàn)假陽性擴(kuò)增；且可用于市售川貝母的真?zhèn)舞b別，同樣，無假陽性擴(kuò)增出現(xiàn)。

本研究首次利用熒光定量PCR 法實(shí)現(xiàn)對(duì)川貝母摻偽品的相對(duì)定量檢測(cè)，利用設(shè)計(jì)的川貝母真品鑒別引物對(duì)1～2，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，得到Ct 值（Ct真）；利用川貝母?jìng)纹疯b別引物對(duì)3～4，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò) 增，得到Ct 值（Ct偽）。只需同時(shí)進(jìn)行2 次實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增，再通過簡(jiǎn)單計(jì)算即可檢測(cè)川貝母樣品中常見偽品的摻偽程度，無需進(jìn)行酶切，且該法允許大量取樣，這極大減少了工作量，縮短了檢測(cè)時(shí)間，并且準(zhǔn)確度高，從而能更好的推廣川貝母的分子鑒定。與傳統(tǒng)的PCR-PFLP 法相比，消除了有毒有害試劑對(duì)試驗(yàn)人員的影響，并且能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，操作更加便捷，大大縮短檢測(cè)周期［15］，以期為川貝母的檢測(cè)提供參考。