高橙皮中檸檬苦素超聲提取工藝的優(yōu)化

尤文挺，江 天，王 灑，何 龍，楊詩(shī)奕，李云岳

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬溫嶺醫(yī)院，浙江 溫嶺317500； 2.臺(tái)州市腫瘤醫(yī)院，浙江 溫嶺317500； 3.溫嶺市茗果高橙專業(yè)合作社，浙江 溫嶺317500）

溫嶺高橙是浙江省溫嶺市傳統(tǒng)的柑橘類品種，早在明代嘉靖《太平縣志》 中就有其種植的記載，其栽培歷史至少有470 年以上，我國(guó)著名園藝學(xué)家吳耕民教授曾專門考證并推定它為葡萄柚原生種［1］。溫嶺高橙果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特、酸甜適中、略帶苦味，當(dāng)?shù)厝苏J(rèn)為它具有清熱降火、醒酒護(hù)肝等功效，深受該市及周邊地區(qū)消費(fèi)者的喜愛［2］，但在日常食用過程中其果皮和種子往往被丟棄，不僅易造成生態(tài)環(huán)境污染，更讓檸檬苦素這種具有潛在藥用價(jià)值的生物活性物質(zhì)白白浪費(fèi)，造成極大的損失。

檸檬苦素是存在于蕓香科、楝科植物中的一類三萜類化合物［3-4］，在柑橘中含有量最高，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗瘧疾、抗病毒、抗菌、神經(jīng)保護(hù)、改善骨質(zhì)量等生物活性［5-6］，隨著相關(guān)研究的深入，如何從植物中提取該成分也越來(lái)越受研究者的關(guān)注。超聲提取作為一種新技術(shù)，它與傳統(tǒng)溶劑提取相比可利用超聲波產(chǎn)生的攪拌、強(qiáng)烈振動(dòng)、高加速度、熱效應(yīng)、空化效應(yīng)等作用來(lái)有效破壞植物細(xì)胞壁，加速細(xì)胞內(nèi)活性成分進(jìn)入提取溶劑，從而提高提取效率，縮短提取時(shí)間，節(jié)約溶劑，并且避免高溫對(duì)提取成分的破壞［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)超聲提取高橙皮中檸檬苦素，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期篩選出一種高效經(jīng)濟(jì)的提取方法，為今后相關(guān)工業(yè)化應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料

1.1 儀器 DHG-9 423 A 鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FW-135 植物粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；SK2510HP 超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；E-UEC-200I 超聲波聲強(qiáng)測(cè)量?jī)x（杭州成功超聲電源技術(shù)有限公司）；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；Waters 2695 HPLC 色譜儀、Waters 2487 紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters 公司）；DU800 紫外／可見光分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman 公司）；BS110S 電子分析天平 （德國(guó)Sartorius 公司）；PHS-3C 型精密PH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.2 試劑與藥物 新鮮高橙于2015 年12 月由溫嶺國(guó)慶塘高橙場(chǎng)、溫嶺塢根茗果高橙專業(yè)合作社提供，丟棄過度成熟和有損壞者，符合要求者通過手工剝皮并切碎，將皮置于45 ℃干燥箱中干燥至恒定質(zhì)量，植物粉碎機(jī)粉碎，篩選出40～100 目粒度放入密封樣品袋中，置于干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩幟士嗨貙?duì)照品（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）。乙腈為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；乙醇、二氯甲烷為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 超聲提取在超聲波清洗器中進(jìn)行，最大輸入功率為250 W，工作頻率為53 kHz。取高橙皮5.0 g，置于250 mL 錐形瓶中，加入適當(dāng)體積不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，懸空置于離底面3 cm 高度的位置，在53 kHz頻率、不同參數(shù)下提取。同時(shí)，錐形瓶在超聲波清洗器自帶的溫度控制系統(tǒng)中保持對(duì)應(yīng)的恒溫，提取后抽濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)醇味，100 mL 二氯甲烷分3 次萃取，保留并合并二氯甲烷相，45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，瓶壁殘?jiān)靡译娑ㄈ葜?0 mL，過0.45 μm 疏水膜，即得。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取檸檬苦素對(duì)照品10.0 mg，乙腈定容，制成1.0 mg／mL 貯備液，取適量依次稀釋成0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025 mg／mL，即得。

2.3 檸檬苦素含有量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；ZORBAX Eclipse Plus C18保護(hù)柱（4.6 mm × 12.5 mm）；流動(dòng)相乙腈-水，等度洗 脫（45 ∶55）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 檸檬苦素HPLC 色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 將 “2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下平行進(jìn)樣測(cè)定5 次，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝7 017 548.627X-7 854.429 （R2＝0.999 992），在0.025～1.0 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。另外，該方程檢測(cè)限為1.793 μg／mL，定量限為5.435 μg／mL。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2” 項(xiàng)下同一對(duì)照品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下平行進(jìn)樣測(cè)定6 次，每次10 μL，測(cè)得檸檬苦素峰面積RSD 為0.61%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2” 項(xiàng)下同一對(duì)照品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下每隔4 h 連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，每次10 μL，測(cè)得檸檬苦素峰面積RSD 為1.7%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液6 份，在“2.2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每次10 μL，測(cè)得檸檬苦素峰面積RSD 為2.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 檸檬苦素提取率測(cè)定 精密吸取“2.1” 項(xiàng)下供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算提取率，公式為提取率（mg／100 g） ＝C×V／M×100，其中C為檸檬苦素含有量（mg／mL），V為定容體積（mL），M為干燥高橙皮質(zhì)量（g），平行3 份，取平均值。

2.4 單因素試驗(yàn) 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比20 ∶1、提取時(shí)間60 min，考察不同功率（150、175、200、225、250 W） 下不同聲強(qiáng) （0.049 5、0.098 6、0.159 5、0.255 6、0.384 0 W／cm2） 對(duì)檸檬苦素提取率的影響；固定聲強(qiáng)0.159 5 W／cm2、液料比20 ∶1、提取時(shí)間60 min，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）對(duì)該成分提取率的影響；固定聲強(qiáng)0.159 5 W／cm2、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間60 min，考察不同液料比（10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1） 對(duì)該成分提取率的影響；固定聲強(qiáng)0.159 5 W／cm2、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比20 ∶1，考察不同提取時(shí)間（30、45、60、75、90 min）對(duì)該成分提取率的影響。

2.5 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇聲強(qiáng)（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、液料比（C）、提取時(shí)間（D） 作為影響因素，檸檬苦素提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34） 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（n＝3）

表3 方差分析

由表2 可知，各因素影響程度依次為B＞C＞A＞D，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞液料比＞聲強(qiáng)＞提取時(shí)間；由表3 可知，因素A、B、C有顯著影響 （P＜0.05），最優(yōu)工藝為A2B2C3D3，但由于D無(wú)顯著影響（P＞0.05），并考慮到時(shí)間和成本，故將其修正為A2B2C3D1，即聲強(qiáng)0.255 6 W／cm2，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液料比30 ∶1，提取時(shí)間30 min。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“2.5” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得檸檬苦素提取率分別為61.87、59.82、61.01 mg／100 g，平均60.90 mg／100 g，表明工藝合理可行，可大大節(jié)約提取時(shí)間。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，50%乙醇超聲提取后高橙干燥皮中微粒會(huì)吸附大量提取液而出現(xiàn)膨脹，導(dǎo)致難以過濾，之后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)醇味的提取液在萃取時(shí)出現(xiàn)了乳化現(xiàn)象，使得提取液損耗嚴(yán)重，從而降低了檸檬苦的提取率。相關(guān)研究表明［8］，造成上述現(xiàn)象的原因是由于在水比例相對(duì)較高的提取液中和超聲、加熱環(huán)境下，果皮組織樣品吸水膨脹加劇，果膠提取率顯著增加，而提取液中果膠具有良好的乳化能力；在醇比例較高的提取液中（90%），由于果膠溶于水而難溶于乙醇，高體積分?jǐn)?shù)乙醇給提取體系帶來(lái)的溶解效益越來(lái)越小，果膠開始從溶液主體中沉淀下來(lái)［9］，附著在高橙皮微粒的表面，阻礙檸檬苦素?cái)U(kuò)散，導(dǎo)致其提取率急劇下降。因此，合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)于提取率的提高優(yōu)化至關(guān)重要。

液料比對(duì)天然藥物提取過程具有重要影響，由Fick 擴(kuò)散第二定律推導(dǎo)出的動(dòng)力學(xué)模型分析可得，液料比較低時(shí)，有效成分溶解不充分，溶液過早進(jìn)入飽和；液料比較高時(shí)，有效成分快速溶解，可提高擴(kuò)散速度［10-11］。在工藝優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)較小的液料比（10 ∶1） 會(huì)導(dǎo)致檸檬苦素在提取液中的含有量相對(duì)較高，而與高橙皮細(xì)胞液之間的濃度差較小，不利于物質(zhì)擴(kuò)散，進(jìn)而降低提取效率；當(dāng)液料比增加，濃度差擴(kuò)大時(shí)，可加速檸檬苦素?cái)U(kuò)散，從而提取率得到改善。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同功率下聲強(qiáng)變化對(duì)超聲提取高橙皮中檸檬苦素的影響并不占主導(dǎo)地位。一般情況下，超聲波清洗器在功率范圍內(nèi)的聲強(qiáng)條件下通常可產(chǎn)生穩(wěn)態(tài)空化作用，加上超聲的攪拌和傳質(zhì)能力［12］，能有效擊破高橙植物細(xì)胞壁，加速細(xì)胞內(nèi)容物的釋放和提取［13］，從而增加檸檬苦素提取率。然而，研究中超聲清洗器功率有限，無(wú)法觀察到更大聲強(qiáng)對(duì)提取的影響，可能制約了聲強(qiáng)因素對(duì)提取的影響程度。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的高橙皮中超聲提取檸檬苦素工藝經(jīng)濟(jì)高效，以期為今后相關(guān)工業(yè)化應(yīng)用提供一定的參考。