靈芝三萜通過Wnt／β-catenin 信號通路對肝癌細胞增殖和凋亡的影響

蔡 蕤

（鄭州市第七人民醫院藥學部，河南 鄭州450000）

肝癌是世界常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率和死亡率呈上升趨勢［1］。據統計，2015 年全球肝癌發病率為85萬，死亡率為81 萬（高居世界惡性腫瘤第2 位），其中，乙型肝炎病毒感染和酗酒是引起肝癌患者死亡的主要原因［2-3］。雖然肝癌的臨床治療有手術、放療、化療、免疫治療等多種形式，但其發病隱匿、易轉移、復發率高，且放、化療治療不良反應較大，在改善肝癌患者生存率方面仍面臨巨大挑戰［4-5］。

傳統中醫藥療法是我國的特色治療方式，應用范圍廣［6］。靈芝Ganoderma Lucidum是我國的一種傳統名貴藥材，具有補益五臟、止咳平喘、養肝護肝、補氣安神的功效［7］。靈芝三萜是靈芝的主要成分之一，常用于腫瘤的輔助治療［8］。已有研究［9］表明，靈芝三萜能夠增強紫杉醇對乳腺癌細胞增殖的抑制和凋亡的作用，抑制異種移植瘤生長。本研究通過研究靈芝三萜對HepG2 人肝癌細胞增殖、凋亡及Wnt／β-catenin 信號通路的影響，探討靈芝三萜預防及治療肝癌的作用。

1 材料

1.1 細胞株 HepG2 人肝癌細胞（批號HB-8065） 購自美國模式培養物保存所。

1.2 藥物與試劑 靈芝三萜（純度為99 %） 購自杭州甫洛生物科技有限公司，溶解于二甲基亞砜；胎牛血清（批號12483012）、胰蛋白酶（批號20230）、二甲基亞砜（批號TS-20688） 購自美國Thermo Fisher 公司；RPMI-1640 培養液（批號21875-091） 購自美國Gibco 公司；XAV-939 通路抑制劑（批號S1180） 購自美國Selleck Chemicals 公司；LiCl 通路激活劑（批號A100416） 購自上海生工生物工程股份有限公司；Annexin V-FITC／PI 細胞凋亡檢測試劑盒（批號40302ES20） 購自上海翊圣生物科技有限公司；雙蒸水ddH2O （批號PER 018-1） 購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；PVDF 膜（批號BSP0161）、BCA 試劑盒（批號PC0020）、RIPA 裂解液（批號R0020） 購自北京索萊寶科技有限公司；MTT （批號M2129） 購自美國Sigma 公司；兔抗人p-GSK-3β多克隆抗體（批號SC-11757）、兔抗人βcatenin 多克隆抗體（批號NBP1-32239）、兔抗人GAPDH多克隆抗體（批號LS-C108027）、ECL 化學發光試劑盒（批號36208ES60） 購自上海煊翎生物科技有限公司；兔抗人c-myc多克隆抗體（批號EPR17924）、兔抗人cyclin D1多克隆抗體（批號EPR2241）、兔抗人caspase-3 多克隆抗體（批號ab13847）、兔抗人caspase-8 多克隆抗體（批號ab25901） 購自英國Abcam 公司。

1.3 儀器 MCO-18AC 型CO2培養箱購自日本SANYO 公司；流式細胞儀購自美國BD 公司；HBS-1096B 型酶標儀購自南京德鐵實驗設備公司。

2 方法

2.1 細胞培養 使用含10 % 胎牛血清的RPMI-1640 培養液于37 ℃、5 %CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養HepG2細胞，每隔2 d 換液1 次。

2.2 MTT 檢測

2.2.1 不同濃度靈芝三萜對HepG2 細胞增殖的影響 待細胞生長至對數期，收集HepG2 細胞，胰酶消化并重懸，調整細胞濃度為1×106／mL 并接種至96 孔板。將細胞分為靈芝三萜低、中、高劑量組（10、50、100 μg／mL），按不同分組加入靈芝三萜處理HepG2 細胞24、48、72 h，加入20 μL質量濃度為5 mg／mL 的MTT，繼續孵育4 h；棄去多余培養基，加入150 μL 二甲基亞砜振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm 處吸光度值（OD）。每組6 個復孔，實驗重復5 次。

2.2.2 靈芝三萜通過Wnt／β-catenin 信號通路影響HepG2細胞增殖 待細胞生長至對數期，收集HepG2 細胞，胰酶消化并重懸，調整細胞濃度為1×106／mL 并接種至96 孔板。將細胞 分為對照組 （DMSO）、靈芝三萜組（100 μg／mL）、XAV-939 組（20 μmol／L 抑制劑）、LiCl 組（20 mmol／L 激活劑）、靈芝三萜+ddH2O 組（100 μg／mL+ddH2O）、靈芝三萜+LiCl 組（100 μg／mL+20 mmol／L 激活劑）；細胞分別按不同分組加入藥物處理24、48、72 h，MTT 處理按照“2.2.1” 項下MTT 處理方法。每組6 個復孔，實驗重復5 次。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

2.3.1 不同濃度靈芝三萜對HepG2 細胞細胞凋亡的影響 按照“2.2.1” 項下分組處理細胞，細胞常規培養24、48、72 h 后，加入胰酶消化，于4 ℃、300g條件下離心，收集細胞，利用Annexin V-FITC／PI 細胞凋亡檢測試劑盒，依次加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，輕輕混勻后于室溫避光孵育15 min，置流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.3.2 靈芝三萜通過Wnt／β-catenin 信號通路影響HepG2細胞凋亡 按照 “2.2.2” 項下分組處理細胞，按照“2.3.1” 項下流式細胞儀術方法檢測細胞凋亡。

2.4 Western blot 檢測 按照“2.2.2” 項下對照組、靈芝三萜組分組，細胞培養24、48、72 h，使用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液置于冰上進行裂解，4 ℃、12 000g離心20 min，以提取蛋白。通過BCA 試劑盒測定蛋白濃度，取40 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳。電泳結束后將蛋白樣品電轉至PVDF 膜上，將膜在含5 % 脫脂奶粉的TBST 液中室溫封閉1 h；之后分別加入兔抗人c-myc 多克隆抗體（1 ∶1 000）、兔抗人cyclinD1 多克隆抗體（1 ∶1 000）、兔抗人caspase-3 多克隆抗體（1 ∶500）、兔抗人caspase-8 多克隆抗體 （1 ∶ 500）、兔抗人p-GSK-3β 多克隆抗體（1 ∶500）、兔抗人β-catenin 多克隆抗體（1 ∶500）、兔抗人GAPDH 多克隆抗體（1 ∶1 000），4 ℃孵育過夜；膜洗滌后加入辣根過氧化物酶（HRP） 標記的二抗室溫孵育2 h；用TBST 洗膜，ECL 試劑盒顯示條帶。以GAPDH 為內參，檢測蛋白表達，實驗重復3 次。

2.5 統計學分析 采用SPSS 22.0 統計軟件，數據以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 不同濃度靈芝三萜對HepG2 細胞增殖的影響 不同濃度靈芝三萜分別作用HepG2 細胞24、48、72 h，靈芝三萜抑制HepG2 細胞增殖（P＜0.05），且濃度越高，抑制作用越強。見表1。

表1 不同濃度靈芝三萜對HepG2 細胞增殖的影響（， n＝5）

表1 不同濃度靈芝三萜對HepG2 細胞增殖的影響（， n＝5）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與靈芝三萜低劑量組比較，#P＜0.05；與靈芝三萜中劑量組比較，△P＜0.05。

3.2 不同濃度靈芝三萜對HepG2 細胞凋亡的影響 與對照組比較，靈芝三萜組細胞凋亡率增加（P＜0.05），且濃度越高，細胞凋亡越多，見表2。100 μg／mL 靈芝三萜對HepG2 細胞增殖的抑制作用和細胞凋亡的促進作用最強，選取100 μg／mL靈芝三萜進行后續實驗。

表2 不同濃度靈芝三萜對HepG2 細胞凋亡的影響（， n＝5）

表2 不同濃度靈芝三萜對HepG2 細胞凋亡的影響（， n＝5）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與靈芝三萜低劑量組比較，#P＜0.05；與靈芝三萜中劑量組比較，△P＜0.05。

3.3 靈芝三萜對HepG2 細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組比較，靈芝三萜（100 μg／mL）作用HepG2細 胞 24、48、72 h，c-myc、cyclinD1 蛋白表 達下調（P＜0.05），caspase-3、caspase-8 蛋白表達上調（P＜0.05），見圖1、表3。

3.4 靈芝三萜對Wnt／β-catenin 信號通路相關蛋白表達的影響 與對照組相比，靈芝三萜 （100 μg／mL） 作用HepG2 細胞24、48、72 h，β-catenin、p-GSK-3β 蛋白表達下調 （P＜0.05）。提示100 μg／mL 靈芝三萜可能影響HepG2 細胞中Wnt／β-catenin 信號通路。見圖2、表4。

圖1 Western blot 檢測各組細胞增殖、凋亡相關蛋白

3.5 Wnt／β-catenin 信號通路對HepG2 細胞增殖、凋亡的影響 20 μmol／L XAV-939 干預HepG2 細胞24、48、72 h，抑制HepG2 細胞增殖（P＜0.05），促進細胞凋亡率增加（P＜0.05）；而20 mmol／L LiCl 干預HepG2 細胞24、48、72 h，促進HepG2 細胞增殖（P＜0.05），抑制細胞凋亡率（P＜0.05）。見表5。

3.6 靈芝三萜通過Wnt／β-catenin 信號通路影響HepG2 細胞增殖、凋亡 單獨以100 μg／mL 靈芝三萜作用HepG2 細胞24、48、72 h 能明顯抑制細胞增殖（P＜0.05），并誘導細胞凋亡（P＜0.05）；而100 μg／mL 靈芝三萜聯合20 mmol／LLiCl 干預HepG2 細胞24、48、72 h，細胞存活較靈芝三萜+ddH2O 組升高 （P＜0.05），同時細 胞凋亡 率降低（P＜0.05）。見表6。

表3 靈芝三萜對HepG2 細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響（， n＝5）

表3 靈芝三萜對HepG2 細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響（， n＝5）

注：與對照組比較，?P＜0.05。

圖2 Western blot 檢測各組β-catenin、p-GSK-3β 蛋白

4 討論

肝癌的發病率占世界惡性腫瘤的第6 位，其中我國肝癌患者占一半以上［10］。肝癌的發生與酗酒、丙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、身體質量指數（BMI）、糖尿病等因素有關，肝炎病毒疫苗接種、肝臟疾病早期篩查、使用中草藥增強細胞免疫功能等方式能有效預防肝癌的發生［11-13］。靈芝三萜具有降血糖、降血脂、增強免疫、抗腫瘤等藥理作用，可由擔子菌門、傘菌綱、靈芝科靈芝中提取［14］。迄今為止，已有400 多個化合物從靈芝中分離并鑒定，其中150 多個為三萜類化合物，靈芝三萜是靈芝提取物中的主要活性成分［15-17］。有文獻［18］報道，靈芝三萜能夠阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡和自噬、抑制腫瘤轉移和血管生成，從而發揮抑癌作用。Yue 等［19］研究發現，靈芝三萜通過參與細胞增殖、氧化應激、鈣信號轉導等生物過程在宮頸癌細胞中發揮抑癌作用；同時，Thyagarajan 等［20］研究發現，靈芝三萜能夠調節自噬效應蛋白Beclin 1 表達，抑制p38 絲裂原活化蛋白激酶磷酸化，用于結腸癌的臨床治療。本研究低、中、高劑量的靈芝三萜均能有效抑制HepG2 人肝癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，且濃度越高、抑制或誘導作用越強。

表4 靈芝三萜對β-catenin、p-GSK-3β 蛋白表達的影響（， n＝5）

表4 靈芝三萜對β-catenin、p-GSK-3β 蛋白表達的影響（， n＝5）

注：與對照組比較，?P＜0.05。

表5 Wnt／β-catenin 信號通路對HepG2 細胞增殖和凋亡的影響（， n＝5）

表5 Wnt／β-catenin 信號通路對HepG2 細胞增殖和凋亡的影響（， n＝5）

注：與對照組比較，?P＜0.05。

表6 靈芝三萜通過Wnt／β-catenin 信號通路對HepG2 細胞增殖、凋亡的影響（， n＝5）

表6 靈芝三萜通過Wnt／β-catenin 信號通路對HepG2 細胞增殖、凋亡的影響（， n＝5）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與靈芝三萜+ddH2O 組比較，#P＜0.05。

Wnt 信號通路自20 世紀80 年代被發現以來，已成為細胞信號傳導領域研究的熱點，包括經典Wnt （Wnt／β-catenin） 信號通路和非經典信號通路，在細胞增殖、分化、凋亡等 過程中 起重要作用［21］。β-catenin 是Wnt／βcatenin 信號通路中的關鍵分子，Wnt 蛋白與卷曲蛋白（Fzd）、低密度脂蛋白受體相關蛋白5／6 或糖原合成酶激酶3β （GSK-3β） 等跨膜受體結合，將Wnt 信號傳遞至胞質蛋白，使β-catenin 由細胞質轉移至細胞核，與T 細胞轉錄因子／淋巴樣增強因子等核內轉錄因子結合而激活c-myc、細胞周期蛋白D1 （cyclin D1）、半胱氨酸蛋白酶（caspase）等下游靶基因［22-24］。Wnt／β-catenin 信號通路與結直腸癌、胃癌等多種腫瘤發展有關。據報道，GSK-3β、β-catenin 在結直腸癌組織中異常表達，調節GSK-3β、β-catenin 表達水平可抑制細胞增殖和轉移［25］；激活Wnt／β-catenin 信號通路則促進胃癌細胞的遷移和侵襲，與胃癌預后不良有關［26］。本研究，100 μg／mL 靈芝三萜能夠上調HepG2 細胞中caspase-3、caspase-8 蛋白表達并下調c-myc、cyclinD1、β-catenin 和p-GSK-3β 蛋白表達，抑制細胞增殖并誘導凋亡。20 μmol／L XAV-939 干預能抑制HepG2 細胞增殖并促進凋亡，而20 mmol／L LiCl 干預則結果相反。使用20 mmol／L LiCl 干預能在一定程度上減弱靈芝三萜對HepG2細胞增殖的抑制和細胞凋亡的誘導作用。

綜上所述，靈芝三萜能夠抑制肝癌細胞增殖并誘導凋亡，其機制可能是通過Wnt／β-catenin 信號通路調節下游靶標c-myc、cyclinD1、caspase-3、caspase-8 表達，從而調節細胞周期和細胞凋亡。