基于網絡藥理學探究銀黃藥對抗病毒作用機制

沈 汶蔣卓霖吳雨晴梁 杰郝宣潤雷奇林

（1.成都醫學院，四川 成都610050； 2.四川科瑞德制藥股份有限公司，中樞神經系統藥物四川省重點實驗室，四川 瀘州646100）

金銀花屬于寒性植物，為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb 干躁花蕾或帶初開的花，為常用中藥。具有清熱解毒、涼散風熱之功效，主治癰腫、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發熱等癥，應用歷史悠久［1］。黃芩始載于《神農本草經》，為唇形科多年生草本植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根。其味苦、性寒，具有清熱燥濕、止血安胎、瀉火解毒、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒等功效［2］。用銀黃配伍制成的銀黃制劑具有清熱解毒、消炎之功效，通常用于治療上呼吸道感染、扁桃體炎、燒傷燙傷感染等［3］?，F在銀黃藥對配伍研究主要集中于銀黃藥對的主成分研究、質量控制及藥理作用研究［4-6］等方面。而病毒在宿主細胞內要成功的復制需要宿主細胞的細胞因子參與，對于其復雜作用機制的研究有助于理解宿主細胞中細胞因子在病毒復制過程中的作用，并指導相關抗病毒新藥開發［7］。但目前尚未見對 銀黃藥對抗病毒的作用機制報道。因此，本文運用網絡藥理學方法探究銀黃藥對抗病毒作用機制及其物質基礎。

1 材料與方法

1.1 銀黃藥對成分篩選 通過文獻調研與挖掘的方法，選取金銀花［8-10］與黃芩［11-13］中主要質量控制與藥效成分共16種，見表1。通過中藥系統藥理學分析平臺［14］（TCMSP，http： ／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php） 與PubChem （https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ／）［15］查找并導出16 種化學分子的三維化學結構數據，保存為?.mol2 文件格式。

1.2 銀黃藥對主要活性成分潛在靶點預測 黃芩主要含有黃酮類成分（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等），金銀花主要含有綠原酸及其異構體等有機酸（綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩帷?，4-二咖啡?？鼘幩幔?和苷類物類（金絲桃苷、木犀草素、忍冬苷、檞皮素）。將導出的化合物分子結構以mol2 （?.mol2） 文件格式提交到PharmMapper 網絡服務器（http： ／ ／59.78.96.61／pharmmapper／） 進行反向對接以預測其作用靶點。PharmMaper 是根據反向藥效團匹配法，實現預測潛在靶點與生物活性成分的對接的服務器。其會對BindingDB、Targetbank、PDTD、Drugbank 4 大數據庫進行檢索以獲取藥物潛在靶點的信息，這使得預測靶點信息更加可靠精確［16］。將選擇靶點集（select target set）設置為“僅人類蛋白質靶點” ［human protein targets only（v2010，2241）］，其余參數不變。下載每個成分的反向對接預測結果，將對接得分Z 值（Z scores） 以降序排列，依據其對接得分選取每個成分的前20 個靶點作為靶點與該化合物相關的重要靶點。由于PharmMapper 對接結果中的藥物靶點存在命名不規范以及為方便進行下一步研究，因此本文采用Uniprot 數據庫的搜索功能（http： ／ ／www.uniprot.org ／）［17］，將得到的靶點代碼統一轉換為人源基因代碼［Organism： Homo sapiens （Human）］。如將Cell division protein kinase 6、Angiogenin、Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src 分別轉換為CDK6、ANG、SRC。在經過轉換之后，獲取活性成分相關的靶點信息。

1.3 藥物-化合物-預測靶點網絡構建與關鍵靶點的篩選 將銀黃藥對中藥物、活性成分、預測靶點導入Cytoscope3.4.0 軟件（http： ／ ／www.cytoscape.org ／） 中構建藥物-化合物-預測靶點 （Drug-compound-predicted target network，DCTN） 網絡。Cytoscape 是一個開放源碼的生物信息分析軟件，其核心架構是網絡，每個節點（node） 表示的是基因、蛋白質或分子，節點與節點之間的邊（edge） 則代表這些它們之間的相互作用，一個節點的度值（degree） 表示網絡中節點與節點相連的數目，度值越大，則這個靶點越有可能是化合物的關鍵作用靶點。使用Cytoscope3.4.0 軟件中的網絡分析工具（NetworkAnalyzer）計算藥物-化合物-預測靶點網絡中的網絡拓撲參數，這些參數包括了度值、介數 （betweeness centralit，BC） 等。BC 表示節點在特定網絡拓撲中所有的最短路徑中經過該節點的數目，反應了節點在特定網絡中的樞紐程度。參考度值及BC 可以確定網絡中的主要節點，進而確定關鍵靶點［18］。因此本文通過分析網絡，確定銀黃藥對作用的關鍵靶點。

1.4 關鍵靶點-關鍵靶點相互作用分析 為了闡明預測靶點蛋白在系統水平上的作用，將銀黃藥對16 種主要活性成分相關的靶點上傳至String 10.0 數據庫（https： ／ ／stringdb.org／），獲取相關蛋白相互作用信息。String 是一個貯存蛋白質相互作用的數據庫，包括已知和預測的蛋白質，每一個蛋白質都會有一個相互作用的打分值，打分值高的則置信度高［19］。選取打分值大于0.9 作為蛋白之間相互作用的高置信度依據，得到關鍵靶點-關鍵靶點相互作用網絡（Key protein-protein interaction network，KPPN）。

1.5 關鍵蛋白質表達位點的確定 蛋白質的表達位置能反應該蛋白質的功能，本文使用人類蛋白質圖譜數據庫（http： ／ ／www.proteinatlas.org）［20］分析蛋 白質的 表達位置。由于與抗病毒作用的靶點主要表達于免疫系統，因此本文統計關鍵蛋白在骨髓與免疫系統中的表達情況。

1.6 KEGG 通路富集分析 利用DAVID v6.8 數據庫［21］對KPPN 網絡中的關鍵靶點進行KEGG 生物通路富集分析。將關鍵基因列表粘貼至DAVID v6.8 數據庫中，以人類全基因組為背景基因和參照集合，獲得通路富集結果。

1.7 構建藥物-成分-預測靶點-KEGG 信號通路網絡 利用Cytoscope3.4.0 軟件構建關鍵靶點-KEGG 信號通路（Key target-KEGG signaling pathway network，KTKN），并使用Cytoscope3.4.0 軟件Merge 功能將DCTN 與KPPI 以及KTKN 網絡融合，得到藥物-化合物-關鍵靶點-KEGG 信號通路網絡 （Drug-compound-key target-KEGG signaling pathway network，DCTK）。

2 結果

2.1 銀黃藥對成分篩選 通過文獻挖掘，以主要質量控制標志物、藥效成分為指標，共篩選出16 種成分。其中金銀花中有10 種成分，包括綠原酸及其異構體等有機酸和苷類物質。黃芩中共6 種成分，主要為黃芩苷等黃酮類成分。見表1。

表1 銀黃藥對16 種活性成分

2.2 化合物-預測靶點網絡構建與關鍵靶點的篩選 銀黃藥對的藥物-成分-預測靶點網絡見圖1。該網絡圖中含有175 個節點（2 個藥物、16 種成分、157 個靶點） 組成599條相互作用關系在銀黃藥對的藥物-成分-預測靶點網絡圖中，靶點的平均度值為3.45，平均拓撲系數為0.013 6。以度值大于平均度值，拓撲系數大于平均拓撲系數的靶點作為關鍵靶點，其信息見表2。這些靶點中，度值最高的是血管生成蛋白質（angiogeninA，ANG），能與其它8 個節點相互作用；其次是度值為5 的靶點共計8 個，包括1 型非受體酪氨酸蛋白磷酸酶（Tyrosine-protein phosphatase nonreceptor type 1，PTPN1）、胰 腺 α-淀粉酶 （Pancreatic α-amylase，AMY2A）、絲氨酸／蘇氨酸-蛋白激 酶Chk1（Serine／threonine-protein kinase Chk1，CHEK1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src （Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC）、細胞分裂蛋白激酶7 （Cell division protein kinase 7，CDK7）、細胞分 裂蛋白激酶2 （Cell division protein kinase 2，CDK2）、ADP-核糖基環化酶2 （ADPribosyl cyclase 2，BST1）、二氫葉酸還原酶（Dihydrofolate reductase，DHFR）。在藥物-化合物-預測靶點網絡中，每種藥物含有多種成分，每一種成分能作用于多個靶點，每個靶點又能與其它多個靶點發生相互作用，這體現了中藥多成分-多靶點的共同作用機制與整體性的治療思路。

圖1 銀黃藥對的藥物-成分-預測靶點網絡圖

表2 銀黃藥對的藥物-成分-預測靶點網絡中的關鍵靶點及其拓撲學性質

2.3 關鍵靶點蛋白質-蛋白質相互作用分析 將篩選出的關鍵靶點輸入String 10.0 數據庫中，得到關鍵蛋白相互作用網絡（KPPI）。這些靶點之間的相互作用關系如圖2所示。在KPPI 網絡中，DHFR、CDK7、CHEK1、CCNA2、CDK2、SRC、PTPN1 幾個蛋白質之間存在較為密切的相互作用，這提示銀黃藥對在發揮抗病毒作用時可能通過這些靶點網絡發揮作用，同時也提示著各成分之間可能存在的協同作用。

2.4 關鍵蛋白質表達位點的確定 排除掉與其他靶點沒相互作用的靶點，將剩余的關鍵靶點輸入人類蛋白質圖譜數據庫中，統計出各個靶點在人體骨髓與免疫系統中的表達情況，如表3 所示。從表3 可以看出，相關靶點在骨髓與免疫系統中表達程度較高，從側面印證了銀黃藥對具有較好的抗病毒效果。

2.5 KEGG 信號通路富集分析 7 個靶點主要涉及到5 條信號通路（表4）。這5 條通路中，2 條通路與抗病毒作用有關，包括病毒致癌通路（Viral carcinogenesis） 和乙型肝炎通路（Hepatitis B）；2 條與細胞增殖有關，包括細胞周期信號通路（Cell cycle）、細胞粘連信號通路（Adherens junction）；一條與轉導有關，即信號通路p53 信號通路（p53 signaling pathway）。以P＜0.05 為功能顯著性與通路富集臨界值，篩選出與抗病毒相關的信號通路，病毒致癌通路（Viral carcinogenesis）、乙肝病毒通路（Hepatitis B）。

圖2 關鍵靶點之間的相互作用網絡圖

表3 關鍵靶點在人體各組織表達

2.6 藥物-成分-靶點-KEGG 信號通路網絡的建立 使用Cytoscope3.4.0 軟件構建關鍵靶點-KEGG 信號通路網絡（Key target -KEGG signaling pathway network，KKN），并用Cytoscope3.4.0 軟件Merge 功能將DCTN 與KPPI 以及KKN網絡融合，得到藥物-成分-靶點-KEGG 信號通路網絡（DCTK），見圖4，顯示了藥物、成分、靶點、KEGG 信號通路之間的關系。從圖中可以看出，在篩選出來的兩條信號通路中，銀黃藥對中共有5 種成分（金銀花3 種，黃芩2種） 可以作用于這些通路中的關鍵蛋白，這提示這些成分可能是銀黃藥對中發揮抗病毒作用的主要成分。

表4 銀黃藥對關鍵靶點KEGG 信號通路富集分析

圖4 藥物-成分-關鍵靶點-KEGG 信號通路網絡

3 討論

文獻報道銀黃藥對常用制劑如銀黃顆粒［5］、復方銀黃口服液［22］、銀黃注射液［23］等具有體內、體外抗病毒作用。主要成分包括綠原酸、木犀草素、隱綠原酸、黃芩苷、黃芩素等，這與本研究結果一致。除此之外，本研究發現，黃芩中的2s-5，7，2′，6′-四羥基黃酮可能也具有抗病毒作用，目前已經有文獻報道了該化合物具有抗菌作用［24］。

CDK2、CDK7、SRC、DHFR、CHEK1、CCNA2 等幾個靶點是銀黃藥對抗病毒的主要作用靶點。銀黃藥對中的有效成分既可通過直接作用于某一靶點而發揮抗病毒作用；也可通過作用于多個靶點，通過各靶點的相互作用而間接發揮抗病毒作用。CDK2 與CDK7 是細胞周期素依賴性激酶家族成員，與細胞周期的調控有關，作用于中心體與DNA的復制過程。CDK2 能夠使CTNNB1、CDK7、p53／TP53 等蛋白質磷酸化，在G1-S 發揮作用。通過使得cyclin B／CDK1磷酸化來調控cyclin B／CDK1 在中心體與細胞核中的激活，進而控制進入有絲分裂與減數分裂的時期。CDK 家族與多種重要的人類疾病病毒的復制密切相關［25］。在CDK2 功能缺陷型的宿主細胞中，病毒的復制具有感染劑量依賴性，當CDK2 活性被誘導激活時，病毒進入快速的裂解性復制。因此推測銀黃藥對中的有效成分（如綠原酸、木犀草素、隱綠原酸） 能夠抑制CDK2、CDK7 的表達而抑制病毒在人體內的復制過程，進而達到抗病毒的作用。SRC 是一種非受體蛋白酪氨酸激酶。SRC 在病毒感染與腫瘤疾病方面起著重要作用，例如乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）可通過介導SRC 激酶活化以及SRC 激酶家族信號轉導，為HBV 在哺乳動物肝臟內病毒復制提供關鍵功能［26］。因此推測銀黃藥對中的有效成分能抑制SRC 激酶的活化并阻斷相關信號通路達到抑制病毒復制的作用。CCNA2 編碼一種細胞周期蛋白A2，能夠控制細胞周期中的G1／S 和G2／M 過渡階段。其作用機制是通過與CDK1 與CDK2 形成絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶全酶復合物，賦予這些復合物的底物特異性［27］。因此推測銀黃藥對中的有效成分可能通過CCNA2進而調節CDK2 而達到抗病毒的目的。DHFR 編碼二氫葉酸還原酶（Dihydrofolate reductase），二氫葉酸還原酸是葉酸代謝的關鍵酶，能夠催化DNA 前體合成的必要反應。因此推測銀黃藥對中的有效成分通過抑制二氫葉酸還原酶的表達，進而抑制DNA 前體的合成而達到抑制病毒復制的作用。CHEK1 能夠編碼絲氨酸／蘇氨酸蛋白質酶1 （Serine／threonine-protein kinase Chk1），其在由檢查點介導的細胞周期停滯與DNA 修復中是必須的。有研究證明，用CHK 抑制劑處理產生的細胞可以保護它們免受病毒介導的毒性并減少后代病毒的滴度［28］。因此推測銀黃藥對中的有效成分通過抑制CHEK1 的表達，能夠減少病毒對細胞DNA 的損害并修復受損的DNA，同時減少細胞受到的病毒毒性作用。

本文運用網絡藥理學方法報道銀黃藥對的抗病毒作用。發現銀黃藥對抗病毒的作用機制可能是直接或間接抑制與病毒復制相關的關鍵蛋白質的表達，抑制DNA 前體合成而抑制病毒的復制，減少宿主細胞DNA 受損并修復受損的DNA，減少宿主細胞受到的病毒毒性作用。但需要指出的是，本文研究結果仍需要通過進一步的實驗加以證明。